緩沖鹽類型和離子對試劑非對離子對強離解酸性化合物離子對反相液相色譜保留行為的影響

劉小蘭, 高 薇, 梁 超, 喬俊琴*, 王 康, 練鴻振*

(1. 生命分析化學國家重點實驗室, 南京大學化學化工學院, 南京大學現代分析中心, 江蘇 南京 210023; 2. 泰州醫藥高新技術產業園區公共平臺服務中心, 江蘇 泰州 225300; 3. 濟川藥業集團有限公司, 江蘇 泰興 225441)

反相液相色譜(RPLC)因具有良好的選擇性,已成為當今應用最為廣泛的色譜分離模式。然而,在分析一些離解性強的化合物時,單一的RPLC體系并不能得到滿意的分離效果[1]。離子對反相液相色譜法(IP-RPLC)通過在流動相中添加離子對試劑,增強帶相反電荷溶質的保留從而改善分離,主要用于強離解化合物的分離分析[2-7]。在IP-RPLC的應用研究中,科研工作者對影響化合物保留行為的因素一直頗為關注,開展了較為廣泛的研究。Fletouris等[8]采用烷基季銨鹽作為離子對試劑,對多種青霉素進行IP-RPLC分析,研究了配對離子鏈長度、流動相pH和濃度,以及柱溫對青霉素保留行為的影響。Lu等[9]利用IP-RPLC梯度洗脫研究了氯雷他定及其8種相關化合物的保留行為與流動相pH以及離子對試劑濃度之間的關系。劉文霞等[1]將十二烷基硫酸鈉(SDS)作為流動相添加劑,考察了不同色譜條件對表阿霉素及其6種相關物質保留行為的影響,為表阿霉素及其相關物質的分離測定提供了新思路。Burmaoglu等[5]采用蒸發光散射檢測器,分別考察了離子對試劑濃度、有機調節劑類型、流動相pH、色譜柱類型、柱溫等對唑來膦酸及其相關雜質保留行為的影響,建立了最佳分離分析策略。很顯然,在IP-RPLC的應用研究中,人們主要關注離子對試劑的濃度及對離子(counter ion)類型、緩沖溶液的濃度及pH、柱溫等對保留的影響,而離子對試劑中的非對離子(non-counter ion)以及緩沖鹽類型對溶質保留行為的影響研究相對較少。

定量結構-保留行為關系(QSRR)模型可以溝通溶質保留與疏水性參數正辛醇-水分配系數(logP)之間的關系,可用于溶質保留行為的預測或者logP的測定[10]。對于離解性化合物,通常用表觀正辛醇-水分配系數logD代替logP。研究[11]發現,在RPLC中以100%水相作流動相時的保留因子對數值(logkw)與logP或logD之間具有很好的相關性。Logkw可由線性溶劑強度(linear solvent strength, LSS)模型外推獲得[12]:

logk=logkw-Sφ

(1)

k為溶質的保留因子,φ是流動相中有機調節劑的體積分數,S是線性回歸得到的常數。

當溶質在流動相和固定相上達到相等分配(k=1, logk=0)時,對應的有機調節劑比例稱為色譜疏水指數(chromatographic hydrophobicity index, CHI)。有文獻[13,14]指出,在引入溶質氫鍵描述符的情況下,CHI與logP以及logD之間也存在著較好的線性關系。CHI可通過logkw和S計算[15]:

CHI=logkw/S

(2)

本文以14種磺酸化合物為研究對象,在硅膠基質C18柱上,以甲醇為有機調節劑,采用IP-RPLC進行保留行為研究。首先,固定流動相中離子對試劑為四丁基溴化銨不變,考察緩沖鹽類型(磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨)對磺酸化合物保留行為的影響;然后,固定流動相中緩沖鹽為磷酸二氫銨不變,考察四丁基季銨鹽離子對試劑(四丁基溴化銨、四丁基磷酸二氫銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基硝酸銨和四丁基乙酸銨)中陰離子對磺酸化合物保留行為的影響,并探索了IP-RPLC的保留機制。最后,對logkw、S、CHI與logD的相關性進行了比較。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

實驗所用高效液相色譜儀為Waters Alliance 2695(Waters,美國),儀器配有真空脫氣機、數碼四元泵和120位自動進樣器。數據的采集和處理均在Waters Empower色譜管理系統中進行。用996紫外-可見二極管陣列(PDA)檢測器在每個化合物的最佳吸收波長處檢測其吸收峰。流動相pH值使用SevenMulti型pH/電導率/離子綜合測試儀(Metter-Toledo,瑞士)測量。

實驗中所用甲醇(HPLC級)購自美國Honeywell公司,所用水均為飲用純凈水(杭州娃哈哈集團);分析純磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、乙酸銨、氯化銨、氨水(25%～28%)、磷酸(85%)、冰乙酸(98%)和鹽酸(36%～38%)均購自南京化學試劑股份有限公司;四丁基溴化銨(99%)購自百靈威公司(上海),四丁基硫酸銨(99%)購自安耐吉化學(上海),四丁基乙酸銨(98%)和四丁基磷酸氫銨(99%)購自畢得醫藥科技有限公司(上海),四丁基硝酸銨(99%)購自艾覽化工科技有限公司(上海)。

本實驗中對14種磺酸類化合物進行研究,具體信息見表1。其中,logD7.0值(pH=7.0條件下的logD值)是由本課題組前期工作中利用IP-RPLC測試得到的實驗值[16], pKa值由ACD/Labs軟件計算得到,溶質靜電荷ne、氫鍵酸性參數A、氫鍵堿性參數B、極性表面積PSA由https://ilab.acdlabs.com/iLab2/獲取?；撬峄衔锓謩e購自Accu Standard(美國)、TCI(日本)、國藥集團化學試劑有限公司(上海)、Acros Organics(美國)、Matrix Scientific(美國)和Sigma-Aldrich(美國)。所有物質的純度均大于98%,用甲醇配制成儲備液(1.0 g/L),置于4 ℃冰箱中備用。

表1 化合物的log D7.0、pKa、ne、A、B和PSA值

1.2 色譜條件

色譜柱:Welch Ultimate?XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:5 μL。各化合物的進樣質量濃度均為50 mg/L,所有樣品的保留時間(tR)均為至少3次獨立進樣的平均值。

流動相①: (甲醇+10 mmol/L四丁基溴化銨)-(20 mmol/L緩沖鹽+10 mmol/L四丁基溴化銨,pH 7.0),分別使用磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨作為緩沖鹽。

流動相②: (甲醇+10 mmol/L四丁基季銨鹽)-(20 mmol/L磷酸二氫銨+10 mmol/L四丁基季銨鹽,pH 7.0),分別使用含不同陰離子的5種四丁基季銨鹽(四丁基溴化銨、四丁基磷酸二氫銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基硝酸銨和四丁基乙酸銨)作為離子對試劑。

1.3 實驗方法

采用尿嘧啶測定死時間t0,所有化合物均使用等度洗脫,根據化合物疏水性差異,每個化合物至少在4個不同的甲醇體積百分數(70%～10%,間隔5%～10%)下測定tR,使用雙點校正法(DP-RTC)校正[17]。根據k=(tR-t0)/tR計算保留因子k,根據方程(1)建立logk-φ方程,求得kw和S值,根據方程(2)計算CHI值。采用Origin 9.4進行相關模型建立及數據分析。

2 結果與討論

2.1 緩沖鹽類型對磺酸化合物保留行為的影響

由于磺酸化合物具有較小的pKa值(見表1),在實驗環境下(pH=7.0)帶有完全的負電荷,為典型的強離解化合物,并且磺酸化合物具有明顯的紫外特征吸收,可用使用最為普遍的二極管陣列檢測器進行檢測,因此,我們選擇磺酸化合物作為模型化合物。在分析強離解酸性化合物時,四丁基季銨鹽為最常使用的離子對試劑,在pH=7.0的條件下,四丁基季銨鹽帶正電荷,與磺酸化合物形成離子對。實驗中采用甲醇作為有機調節劑,固定流動相中離子對試劑為四丁基溴化銨不變,分別以磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨作為緩沖鹽(濃度相同,pH相同),考察緩沖鹽類型對磺酸化合物保留行為的影響。

在不同的甲醇比例下,分別獲取3種緩沖鹽條件下磺酸化合物的k值,并建立logk-φ模型(方程(1)),結果發現,模型的線性相關系數R2均大于0.99。由logk-φ模型獲取每個化合物在不同流動相下的logkw和S值,并根據方程(2)計算各化合物的CHI值。3種緩沖鹽體系下磺酸化合物的logkw、S和CHI值如圖1所示。從圖1a可以看出,氯化銨體系下溶質的logkw值最大,而大部分溶質在磷酸二氫銨體系下的logkw值最小,表明流動相中氯離子的存在有利于增強磺酸化合物的保留。圖1b顯示大部分溶質在氯化銨體系下的S值最大,但SA2、SA4、SA5和SA13在乙酸銨體系下的S值明顯大于其他兩種緩沖鹽體系。圖1c顯示各化合物的色譜疏水指數CHI在乙酸銨體系下最小。盡管在3種緩沖鹽體系下的CHI值存在一定差別,但總體上同一化合物在各體系下對應的CHI值近似相等(見圖1c)。

圖1 不同緩沖鹽體系下磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 1 (a) log kw(logarithm of retention factors of soluteswhen 100% aqueous phases were used as the mobile phase), (b) S (intercept of the linear solvent strength model) and (c) CHI (chromatographic hydrophobic index) values for sulfonic acid compounds with different buffer solutions

2.2 離子對試劑非對離子對磺酸化合物保留行為的影響

圖2 離子對試劑不同陰離子時磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 2 (a) log kw, (b) S and (c) CHI values forsulfonic acid compounds with different ion-pair reagents Br-, CH3COO-, represent different quaternary ammonium ion-pair reagents (tetrabutylammonium bromide, tetrabutylammonium hydrogen sulfate, tetrabutyl ammonium acetate, tetrabutylammonium hydrogen phosphate and tetrabutylammonium nitrate, respectively).

2.3 IP-RPLC的保留機理

對IP-RPLC的保留機理一直存在著兩種不同的觀點,一種認為是離子對模式保留機理,離子對試劑與帶相反電荷的分析物在流動相中首先形成中性物質,然后中性物質分配到疏水性固定相中[19];另外一種認為是動力學離子交換模式保留機理,離子對試劑首先被吸附到固定相上,在固定相表面產生電荷位點,作為帶相反電荷分析物的離子交換位點[20]。

在動態離子交換模式保留機理中,疏水性的四丁基銨鹽可以吸附在固定相表面,形成雙電層,磺酸化合物通過與陰離子的交換實現保留,保留主要取決于磺酸化合物所帶陰離子電荷的數量。然而,我們的實驗表明,具有2個凈電荷(ne=-2)的化合物SA2、SA6、SA10的保留(logkw)甚至比相同色譜條件下只有1個凈電荷(ne=-1)的化合物(SA7、SA12等)的保留弱(見圖1a和2a)。相反,保留最強的化合物為SA11,對應凈電荷為-1.14,具有最大的logD值(-0.33),即疏水性最強。因此,動態離子交換模式保留機理占主導地位不成立,猜測離子對模式保留機理占主導地位。

2.4 log kw、S、CHI與log D相關性的比較

在IP-RPLC模型下,電荷作用和氫鍵作用均會影響離解化合物的保留,可以在logD-logkw模型中引入溶質靜電荷ne、氫鍵酸堿性參數A和B,建立QSRR模型[14],用于logD或保留的預測。在磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨3種緩沖鹽體系下,我們分別以14種磺酸化合物的logD7.0、logkw、ne、A和B進行多元線性擬合,建立QSRR模型,結果如表2所示?？梢钥闯?3種流動相條件下的logD7.0和logkw之間均有良好的線性相關性,R2達到0.98。為了進一步改善方程的相關性,我們將溶質的極性表面積PSA引入到上述方程中,發現方程的R2進一步增大,線性得到改善。同樣,在引入參數ne、A和B的情況下,以S對logD7.0作線性方程,可以得到良好的線性相關性,當引入PSA后,氯化銨體系下的線性相關性得到明顯改善,線性相關系數R2由0.96增大到0.99(見表2)。最后,分別對3種緩沖鹽體系下得到的CHI對logD7.0進行線性擬合,結果顯示,PSA引入前后logD7.0-CHI模型的線性相關性R2均在0.98以上。表2中的結果表明,溶質的極性表面積PSA會影響溶質的保留,PSA的加入有利于logD7.0-logkw、logD7.0-S和logD7.0-CHI模型的改善。

引入溶質靜電荷ne、氫鍵酸堿性參數A和B、極性表面積PSA,分別用14種磺酸化合物的logD7.0值與在5種不同離子對試劑條件下得到的logkw、S以及CHI值,進行多元線性擬合,得到如表3所示的線性方程?？梢钥闯?logD7.0和logkw、S以及CHI之間均具有良好的線性關系,相關系數R2均在0.98以上。

用IP-RPLC研究logD相關的QSRR模型,通常以logkw作為疏水性指數,建立logD和logkw之間的線性關系。我們的研究發現,logD與S以及CHI之間也具有良好的線性相關性。強離解酸性化合物進行IP-RPLC分析時,當流動相中使用不同的緩沖鹽陰離子或者離子對試劑陰離子,即使得到的logkw和S值存在一定差異,但最終獲取的色譜疏水指數CHI幾乎相等。因此,相比logkw和S而言,CHI更適用于QSRR模型的建立。

3 結論

本研究發現IP-RPLC中緩沖鹽陰離子以及離子對試劑陰離子均會影響磺酸化合物的保留行為。相同離子對試劑情況下,氯化銨體系下的logkw最大;相同緩沖鹽的情況下,離子對試劑中弱離解性陰離子(乙酸根)的存在有利于增加磺酸化合物的S值。我們推測磺酸化合物的IP-RPLC保留機理同時存在著離子對模式和動態離子交換模式,并以離子對模式為主。對于強離解酸性化合物,由于在IP-RPLC不同緩沖鹽和不同非對離子條件下獲得的logkw和S值存在著一定的差異,而CHI值相對穩定,因此CHI更適用于QSRR模型的建立。