發酵蟲草菌粉及產品指紋圖譜建立及多指標成分分析

曹 穩, 洪 亮, 楊 明, 李紹平*, 趙 靜*

(1. 澳門大學中藥質量研究國家重點實驗室, 澳門 999078; 2. 江西國藥有限責任公司, 江西 南昌 330096)

發酵蟲草菌粉(fermentedCordycepspowder)是從天然冬蟲夏草中分離出的蟲草菌經液體發酵培養所得菌絲體的干燥粉末[1]。發酵蟲草菌粉的主要化學成分與冬蟲夏草類似,但價格相對較低,常作為天然蟲草的替代品[2-4],具有補益肺腎、秘精益氣的功效[5]。市面上以發酵蟲草菌粉為原料的制劑有金水寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊等[6]。核苷類成分是發酵蟲草菌粉中的關鍵成分,2020版《中國藥典》中收載的發酵蟲草菌粉制劑金水寶片/膠囊的質量標準中規定以鳥苷、腺苷、尿苷的總含量作為評價相關產品質量的標準,百令膠囊以腺苷含量作為測定標準[1]。但發酵蟲草菌粉中除上述3種核苷類成分外,還有許多其他的核苷類成分[7],這些成分對于菌粉和相關產品質量評價的影響尚未被討論。因此,本文希望通過對發酵蟲草菌粉及產品中核苷類成分的分析,探討其質控指標選擇的合理性。

中藥指紋圖譜能充分反映中藥的化學成分信息,具有整體性和全面性,是評價中藥質量的常用方法[8-11]。統計學方法可以對指紋圖譜信息進行處理,結合多個指標對中藥質量進行分類和綜合評價,其中常用的有聚類分析和主成分分析[12-14]。在對指紋圖譜的分析中,本文首次在主成分分析中引入權重計算來獲得發酵蟲草菌粉共有峰的權重值,以權重值的大小選擇其中的指標性成分。在得到指標性成分后,使用聚類分析進一步驗證指標性成分能否代替共有峰實現對不同的樣品的區分,從而判斷指標性成分的選擇是否可信。

本文采用超高效液相色譜-紫外檢測法建立了發酵蟲草菌粉和市面上3種膠囊產品的指紋圖譜,測定了其中9種核苷類成分的含量。通過化學模式識別對指紋圖譜進行評價,并結合統計學提供了一種新的分析、驗證指標性成分的方法,為發酵蟲草菌粉和產品的質控指標選擇提供了科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000超高效液相色譜系統,包括自動進樣器、在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱和UV檢測器(Thermo,美國);加壓溶劑萃取儀(Dionex,美國);超聲清洗儀(Branson,美國);十萬分之一分析天平(Mettler Toledo,瑞士); Milli-Q Direct一體化超純水機(Millipore,德國)。

對照品尿嘧啶(uracil)、胞苷(cytidine)、鳥嘌呤(guanine)、胸苷(thymidine)、尿苷(uridine)、腺嘌呤(adenine)、肌苷(inosine)(純度≥99%, Sigma-Aldrich,美國),鳥苷(guanosine)、腺苷(adenosine)(純度≥98%, 北京索萊寶有限科技公司),甲醇(色譜純,Merck,德國)。

發酵蟲草菌粉原料10批(依次標記為S1～S10)，心肝寶膠囊3批(批號:18190401、18200402、18200401，依次標記為S11～S13，河北長天藥業有限公司)，百令膠囊3批(批號:1911366、1908318、1907333，依次標記為S14～S16，杭州中美華東制藥有限公司)，寧心寶膠囊3批(批號:200401、200402、200103，依次標記為S17～S19，上海普康藥業有限公司)，每個膠囊產品取20粒，分別混合均勻后作為待測樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18分析柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm),柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,流動相甲醇(A)和水(B)。梯度洗脫程序:0～8.0 min, 0%A; 8.0～8.5 min, 0%A～5%A; 8.5～20.0 min, 5%A～25%A; 20.0～22.0 min； 25%A～100%A。進樣量5 μL，檢測波長260 nm。

1.2.2對照品溶液制備

分別稱取對照品適量,精密稱定,加水溶解制成質量濃度為10.7 mg/L尿嘧啶、3.8 mg/L胞苷、10.4 mg/L鳥嘌呤、51.8 mg/L尿苷、10.1 mg/L腺嘌呤、2.1 mg/L肌苷、40.6 mg/L鳥苷、3.7 mg/L胸苷、50.5 mg/L腺苷的對照品溶液。

1.2.3供試品溶液制備

取樣品粉末0.5 g,精密稱定。加入水25 mL,稱量。超聲(功率881 W,頻率43 kHz)處理10 min,放冷,加水補足減少的質量,以3 000 r/min離心15 min,取上清液過0.45 μm濾膜待用。

2 結果與討論

2.1 樣品提取方法的考察

分別采用超聲輔助提取法和加壓溶劑萃取法提取發酵蟲草菌粉樣品,在優化條件下,兩種提取方法得到的9種核苷含量無顯著差異(見圖1a)。由于超聲輔助提取樣品的操作更為簡單,且超聲提取儀器更常見[15],因此選擇超聲輔助提取作為樣品的提取方法。同時實驗對超聲提取時間進行了考察(10、20、30、40 min),結果顯示,不同超聲提取時間得到的核苷含量無顯著差異(見圖1b)。因此選擇室溫下超聲輔助提取10 min作為樣品的提取條件,并以此條件提取全部樣品。

圖1 不同(a)提取方法和(b)超聲提取時間對樣品中核苷峰面積的影響Fig. 1 Effect of different (a) extraction methodsand (b) ultrasound time on the peak areas of nucleosides in the samples

2.2 方法學考察

分別精密吸取適量對照品溶液,加水稀釋成5個不同濃度的對照品溶液,按1.2.1節方法進樣測定,以峰面積(Y)對對照品質量濃度(X, mg/L)進行線性回歸。9個組分在各自的范圍內線性關系良好,回歸系數(R2)均不小于0.999(見表1)。

表1 9個核苷成分的回歸方程、線性范圍、相關系數

取混合對照品溶液連續進樣6次,測定檢測系統精密度;取發酵蟲草菌粉1號樣品,按1.2.3節方法平行制備供試品溶液6份,進樣測定重復性;分別在供試品溶液制備后0、4、8、12和24 h進樣,測定樣品穩定性;精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗中9個組分相對保留時間的RSD均小于1.0%,相對峰面積的RSD均小于3.0%,表明儀器的精密度、方法的重復性、樣品的穩定性良好。

取發酵蟲草菌粉樣品6份,分別精密加入與樣品等量的肌苷、胞苷、胸苷、尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、鳥苷、尿苷、腺苷對照品,按優化的超聲提取法處理,進樣測定,計算回收率。各核苷組分的平均回收率為95.6%～101.2%,表明方法的準確度良好。

2.3 含量測定

將19批發酵蟲草菌粉及產品分別按1.2.3節方法制備供試品溶液,按1.2.1節的色譜條件分別進樣測定,其中9種混合標準品溶液的色譜圖見圖2a, 1號樣品的色譜圖見圖2b。依據保留時間鑒定樣品中各核苷成分,并記錄260 nm波長下各成分的色譜峰面積。按外標一點法分別計算各組分的含量,結果見附表1(詳見http://www.chrom-China.com)。不同產品中各核苷成分的含量區別較大,但尿苷、鳥苷、腺苷的含量均比較高。

圖2 (a)混合對照品溶液及(b)1號發酵蟲草菌粉樣品的指紋圖譜Fig. 2 Fingerprints of (a) the mixed standard solution and(b) No. 1 fermented Cordyceps powder sample 1. uracil; 2. cytidine; 3. guanine; 4. uridine; 5. adenine; 6. inosine; 7. guanosine; 8. thymidine; 9. adenosine.

2.4 指紋圖譜的建立

將19批發酵蟲草菌粉及產品的色譜圖導入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版本)”軟件進行處理,生成對照指紋圖譜(R)和樣品的指紋圖譜(見圖3)。19批發酵蟲草菌粉樣品的色譜圖中共識別出16個主要的共有特征峰,根據對照品將9個共有峰分別鑒定為尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷,樣品的各共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%,共有指紋峰的峰面積百分比大于99%。

圖3 發酵蟲草菌粉樣品及產品的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of fermented Cordyceps powder samples and products R: reference fingerprint; S1-S10: fermented Cordyceps powder; S11-S13: Xinganbao capsule; S14-S16: Bailing capsule; S17-S19: Ningxinbao capsule. Peaks 1-9 were the same as that in Fig. 2.

2.5 指紋圖譜評價

2.5.1指紋圖譜的相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版本)”軟件,將對照圖譜作為參照圖譜,計算19批發酵蟲草菌粉及產品指紋圖譜的相似度。各共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%, 19批樣品的相似度均大于0.9,相似度結果見表2。要進一步分析其中的代表性成分,須進行化學模式識別。

表2 19批發酵蟲草菌粉樣品及產品的相似度

2.5.2主成分分析

采用MATLAB軟件,將共有峰的峰面積數據作為變量,分別對發酵蟲草菌粉和3種產品各自進行主成分分析,并計算每個成分的權重值。權重值代表該成分峰對主成分的貢獻,權重值越高,對主成分貢獻越大,將權重值大于0.1的成分作為樣品的指標性成分。經分析，各樣品中指標性成分如下:發酵蟲草菌粉原料中的尿苷(0.24)、鳥苷(0.14)、腺苷(0.14)、尿嘧啶(0.10);心肝寶膠囊樣品中的腺苷(0.20)、尿苷(0.18)、鳥苷(0.17)、尿嘧啶(0.12); 百令膠囊樣品中的尿嘧啶(0.19)、鳥苷(0.18)、腺嘌呤(0.16)、腺苷(0.14)、尿苷(0.10);寧心寶膠囊樣品中的尿嘧啶(0.22)、腺苷(0.21)、腺嘌呤(0.20)、尿苷(0.10)、鳥苷(0.10)。

對19個樣品同時進行主成分分析,其主成分分析得分圖顯示,19個樣品可分為5類(見圖4),分別為:S1～S5、S6～S10、S11～S13、S14～S16和S17～S19。其中S1～S10為10批發酵蟲草菌粉樣品,由兩種發酵工藝制得,不同工藝得到的產品質量存在差異,因此聚為兩類;S11～S13、S14～S16和S17～S19分別為心肝寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊3種產品,來自不同廠家,其生產工藝和生產環境不同,均會造成產品之間的差異。而同種產品不同批次之間的一致性較好,因此各產品單獨聚為一類。對19批樣品同時進行權重計算,有5個成分權重值大于0.1,分別為:尿苷(0.28)、鳥苷(0.14)、尿嘧啶(0.13)、腺苷(0.10)、腺嘌呤(0.10),即這些成分可以作為區別全部樣品的指標成分。

圖4 發酵蟲草菌粉樣品及產品的主成分分析得分圖Fig. 4 Scores of principal component analysis forfermented Cordyceps powder samples and products FJ1: fermented Cordyceps powder (S1-S5); FJ2: fermented Cordyceps powder (S6-S10); XGBJN: Xinganbao capsule (S11-S13); BLJN: Bailing capsule (S14-S16); NXBJN: Ningxinbao capsule (S17-S19).

2.5.3聚類分析

將19批樣品的共有峰峰面積作為變量,導入SPSS軟件中進行聚類分析,結果見圖5a。由結果可知,19批樣品可聚為5類,與主成分分析結果一致。同時,使用主成分分析中篩選出的5個指標成分對19批樣品進行聚類分析,得到的結果如圖5b,與使用全部共有峰進行聚類分析的結果一致,說明僅使用這5種指標成分就可以實現對不同的發酵蟲草菌粉和產品的區分。

圖5 發酵蟲草菌粉樣品及產品的(a)共有峰及(b)指標成分的聚類分析樹狀圖Fig. 5 Cluster analysis dendrograms for (a) commonpeaks and (b) index components of fermented Cordyceps powder samples and products

3 結論

本文建立了一種發酵蟲草菌粉原料和市場上3種主要產品的指紋圖譜,得到了16個共有峰,測定了其中9個核苷的含量,并結合統計學方法分析得到了指標性成分,分別為尿苷、鳥苷、腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶。以上結果表明,該方法可以定量分析發酵蟲草菌粉中多種核苷成分。同時,利用液相色譜指紋圖譜結合化學模式識別,可以分析與評價發酵蟲草菌粉及產品中的指標性成分,為其質量控制提供簡單、可靠的方法。將該分析方法進一步擴展,可以為其他中藥指紋圖譜的建立、指標成分的分析提供參考,為中藥質量評價提供實驗依據。