色譜在藥物-機體復雜巨系統研究中的應用進展

賈 璞, 邊陽陽, 白亞軍, 孟 雪, 高朔漠, 趙 曄, 蔡宇杰, 鄭曉暉*

(1. 西北大學, 陜西 西安 710069; 2. 陜西省中醫藥研究院, 陜西 西安 710004; 3. 江南大學, 江蘇 無錫 214122)

純凈是許多人、事物追求的極致,而色譜就是將復雜體系物質進行純凈化而產生的一門集科學、技術與藝術于一體的學科。

色譜作為一門以分離分析為主的學科,歷經100余年的發展,由19世紀下半葉科學家發現吸附現象,到1938年薄層色譜的出現,再到氣相色譜、液相色譜乃至當今的超高效液相色譜(UHPLC)或超高流速液相色譜(UFLC)及超臨界流體色譜、全二維色譜等[1],色譜理論及技術日臻完善。由于傳統色譜方法的柱容量和檢測器的靈敏度有限,因此結構相近以及低豐度物質的分離、檢測和結構解析存在著比較大的困難。色譜聯用技術的產生為分析領域帶來了跨越性發展。近年來,色譜-質譜聯用技術、色譜-核磁共振波譜聯用技術、氣相色譜-原子發射光譜檢測器聯用技術、毛細管電泳-質譜聯用等新技術的涌現,使色譜在環境、石油化工、食品、生物醫藥等多個領域得到了廣泛的應用[2-5]。

中醫藥是我國傳統文化瑰寶,歷經數千年臨床實踐積淀,療效經久不衰,在抗擊新冠肺炎疫情中,中醫藥取得了有目共睹的效果。我國2017年頒布了《中華人民共和國中醫藥法》,制定了一系列方針政策,旨在推動中醫藥的傳承與發展。國務院先后發布了《中共中央國務院關于促進中醫藥傳承創新發展的意見》《中醫藥發展戰略規劃綱要(2016-2030年)》及《關于加快中醫藥特色發展若干政策措施的通知》等系列政策文件,強調“正確把握好繼承和創新的關系,充分利用現代科學技術和方法,推動中醫藥理論與實踐不斷發展,推進中醫藥現代化”等。與此同時,由于中藥本身是個多成分復雜體系,面臨療效組分與作用機理不明確、部分中成藥被屢報安全問題等,嚴重影響了中醫藥的國際化,因此中醫藥的現代化挑戰重重。2014年,國家聚焦重大戰略需求,整合“973”計劃、“863”計劃等,啟動了國家重點研發計劃,著力解決國民經濟和社會發展各主要領域的重大科技瓶頸問題,解決制約我國科技計劃引領帶動創新發展的深層次重大問題,并將“中醫藥現代化”列為重點研發專項。

色譜理論及技術的迅猛發展,為中醫藥研究奠定了分離、提取純化、現代藥理、制備工藝和分析的基礎[6],對中醫藥的現代化進程起到了巨大的推動作用。

1 色譜技術在中藥復雜體系研究中的應用

中藥是由數以萬計的不同種類的分子組成,其療效的發揮也與其所含物質息息相關。因此,中藥的分子化已成為中藥現代化研究的關鍵制約因素和發展趨勢,這恰與色譜技術的優勢相吻合,使其成為上述研究領域中的主流手段。

中藥的化學成分研究的經典方法即應用柱色譜、薄層色譜等技術對中藥復雜提取液進行逐步的分離、純化、鑒定等。隨著分析科學的不斷發展,廣大色譜分析者在中藥復雜成分的分離和檢測提升方面開展了大量的創新性研究工作,宋月林等[7]建立了非手性-手性色譜-預測多反應監測法,從毛前胡中鑒定出60個化學成分,其中8對香豆素對映異構體得到了良好分離;屠鵬飛等[8]建立了在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜體系,對草蓯蓉化學成分進行快速分析,鑒定出45個化合物,包括10個苯乙醇苷類、14個環烯醚萜苷類以及21個苯丙醇苷類化合物。梁鑫淼等[9]提出了“本草物質組計劃”,即全面解析中藥物質組成、結構和功能,構建本草物質資源庫,闡述中藥的多組分多靶點整合調節機制,為創新中藥發展提供支撐。在此思路指引下,梁鑫淼等[10]開展了系列新型色譜分離材料研究,以此為基礎開發了生物堿、天然寡糖、糖脂以及蛋白/多肽藥物的色譜分離方法,運用親水色譜技術、全二維色譜技術等完成了姜黃、紅花、黃連、桔梗等中藥的化學成分研究。李萍等[11]提出了“中藥等效成分群”,建立了基于化學成分缺失/捕獲-譜效集成表征新方法,該方法利用多種色譜分離技術,從中藥和復方提取物中特異性敲除或敲入目標組分或者化合物,進而進行藥效對比分析,以期從中藥和復方的眾多成分中發現能基本代表復方藥效的等效成分群。

色譜及其聯用技術也推動了中藥及其中成藥的質量控制提升工作,使其不再局限于顯微鑒別、理化鑒別、薄層鑒別等技術。自1985年版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)開始收錄色譜法后[12],高效液相/氣相色譜方法已成為藥物含量分析的基本分析方法,2000年版《中國藥典》首次收錄了毛細管電泳法。隨著色譜填料的優化及與光譜、質譜技術的聯用,新的色譜技術如超高效液相色譜、高效液相-質譜聯用、高效液相色譜-圓二色光譜(HPLC-CD)等技術不斷涌現,分離分析更高效，應用更廣泛。如2015版《中國藥典》采用液相色譜-三重四極桿質譜(LC-QQQ-MS/MS)技術,利用阿膠、鹿角膠、龜甲膠的特征肽段鑒定,為市場上膠類動物類藥材提供了可靠的質量保證。色譜及其聯用技術在中藥復雜成分分析研究及質量控制中將發揮更加重要的作用。

2 色譜技術在復雜生命過程中的辨識應用

蛋白作為生命活動的執行者,其種類及含量的變化在調控生命過程中發揮著至關重要的作用。利用化合物與靶蛋白的高親和性,實現中藥提取物中活性成分的分離和辨識,具有準確度高、特異性好、速度快等特點,極大地推動了中藥藥效物質基礎研究和活性先導化合物的發現。王序等[13,14]以蛋白酶和受體等蛋白為靶標,篩選了近百種中藥的有效成分。鄒漢法等[15,16]進一步提出將蛋白固定在色譜填料表面,利用生物親和色譜方法研究中藥活性成分和質量控制。張麗華等[17-19]的系列研究,提高了膜蛋白組的鑒定數目和覆蓋度,篩選出組織和細胞特異性高表達的受體蛋白,而受體蛋白的選擇,對于基于受體親和色譜方法的中藥活性成分篩選方法,具有至關重要的意義。這些研究工作為基于生物親和色譜的中藥活性成分篩選鑒定打下了堅實的理論和技術基礎。

許國旺等[20]提出了以活細胞為基質的活性成分鑒定方法。在此基礎上,又有研究者建立了基于中空纖維細胞捕獲[21,22]、細胞捕獲-分散液相微萃取以及活細胞固相色譜[23]等篩選方法。這類方法通常需要破壞細胞的完整性,細胞中內源性物質的釋放增加了活性成分鑒定的難度。賀浪沖等[24]將高效液相色譜、細胞生物學和受體藥理學相結合,在國內率先建立了固定化細胞膜親和色譜技術。該技術使用液相色譜分離方法,在動態條件下研究活性物質與細胞膜受體的相互作用。至今,固定化細胞膜色譜法已被成功應用于數十種中藥和復方的活性成分辨識研究[25-27]。由于細胞膜表面天然表達了上百種受體蛋白[28],將篩選到的活性成分與某一種受體蛋白建立特異性相互作用網絡,存在著一定的挑戰。作者研究團隊通過將內皮素A受體(ETAR)、β2腎上腺素受體(β2-AR)、α1A-腎上腺素受體(α1A-AR)、血小板受體(P2Y12)和電壓依賴性陰離子通道蛋白(VDAC)等蛋白固定在色譜填料表面,建立了單一和多靶標受體親和色譜分析方法,用于復雜體系中藥物活性成分的高效、特異性和高準確篩選和鑒定[29-35]。常規親和色譜法常使用大內徑色譜柱,靶標蛋白或酶的用量較大,不太適合來源困難、成本高的靶標蛋白,如血管緊張素轉化酶和蛋白激酶等。江正瑾等[36]及康經武等[37]通過引入整體柱固定化酶技術,實現了中藥活性成分的高靈敏、低成本篩選鑒定。受體和細胞膜親和色譜技術不僅可實現活性物質的快速篩選鑒定,還可以進行結合動力學研究,但是靶標物質的固定化在一定程度上影響其空間構象,為了盡可能模擬生理環境,李紹平等[38,39]構建了基于自由靶標的生物特異萃取結合高效液相色譜分離方法。該方法將中藥和復方提取物與細胞膜或者細胞在緩沖溶液體系中進行孵育,利用超濾、透析等方式去除不結合的化合物,使用高效液相色譜儀有效辨識中藥和復方的活性成分。該方法在活性物質的結合動力學以及親和常數研究方面,尚存在一定的不足。

綜上,在基于生物親和色譜方法的中藥活性成分辨識研究中,色譜基質經歷了從活細胞到細胞膜,最終到純化后的受體、蛋白和酶的發展歷程。通過靶標物質的不斷簡化,構建了清晰明了的靶標蛋白-中藥-活性成分的網路化和信息化數據庫。另外,生物親和色譜方法鑒定到的是與靶標物質在體外環境下,具有一定親和作用的化合物,尚需進一步的活性驗證及在體研究。

3 藥物-機體復雜巨系統中色譜技術的應用

中藥是一個多種類多成分綜合作用的復雜體系,在機體復雜內環境作用下發揮多靶點聯合作用,并由此形成了藥物-機體、藥物-藥物、代謝物質群相互作用的藥物-機體復雜巨系統,給中藥現代化研究帶來了重重困難。色譜及其聯用技術的優勢使其成為上述復雜巨系統研究的主要手段。同時上述復雜巨系統中所產生的數據信息往往是海量的,數學、統計學的思維及技術在此方面起到了至關重要的作用,色譜技術與數理統計學的整合分析極大地推動了藥物-機體復雜巨系統中的蘊藏海量信息的數字化與信息化進程(見圖1)。

圖1 藥物-機體復雜巨系統研究模式Fig. 1 Research approach for the giant complex drug-organism systemPK-PD: pharmacokinetics-pharmacodynamics.

1979年,Sheiner等[40]建立了一個同時描述藥代動力學和藥效學的模型并應用于西藥的研究,隨后該模型被逐漸完善用于中藥的藥效成分研究,即運用色譜及其聯用技術對復方化學物質組的體內過程進行監測,將其與對生物機體的效應關聯起來,以尋找中藥復方藥效物質基礎。該方法在藥物篩選、藥物毒性預測、臨床實驗設計和劑量方案選擇方面做出了突出的貢獻。然而以中藥復方為代表的藥物-機體復雜巨系統中成分種類復雜、數量龐大,同時發揮藥效的成分可能是結構不明確的痕量成分或者代謝物成分,這就給上述技術帶來了極大的挑戰。

20世紀末以來,基因組學、蛋白組學、代謝組學等技術進展迅速,藥物-機體復雜巨系統中所蘊含的海量數據被挖掘展現出來,上述組學及其組合多組學技術(泛組學)也被作為主流技術廣泛應用于疾病機理及藥物作用機制的研究[41-43]。代謝組學等組學常規數據處理方式側重于從內源性物質變化差異性的規律中分析病理病機,而忽略了數據之間的相關性尤其是因果相關乃至互為因果相關,使得統計信息中藥物成分相關信息有限。

面對上述中藥/中藥復方-機體復雜巨系統,王喜軍[44]發展并提出了“中藥血清藥物化學”研究思路,即運用色譜技術乃至多維色譜技術對血中移行成分及其藥動學進行分析,以闡釋藥物在體內的相互作用,旨在尋找中藥復方藥效物質。繼而王喜軍等[45]融合代謝組學技術提出了“方證代謝組學”中藥-機體研究策略,并運用UPLC-MS技術結合模式識別技術等展開了“四君子湯”“茵陳蒿湯”和“生脈散”等中醫經典方的體內藥效物質及質量標志物研究,對其體內靜態代謝數據進行皮爾遜相關性分析,發現了異秦皮素、京尼平苷等9個化合物可作為茵陳蒿湯治療濕熱黃疸病的質量標志物,五味子素、五味子醇甲、人參皂苷F1等8個化合物可作為生脈散治療阿爾茨海默癥的質量標志物[46,47]。該研究強調了物質之間的相關性,能夠初步捕捉藥物有效成分與內源性應答物質的相關性。然而由于時間因素的忽略,該研究體系中藥物-機體協同作用機制及深層次因果關系難以被刻畫,因此藥物-機體復雜巨系統中核心效應物質辨識仍有待完善和提高。

“萬法皆空,因果不空”,因果關系是貫穿于萬物發展過程中的永恒規律,尤其對于復雜巨系統的簡化、解析至關重要。因果關系分析基本思想最早體現在Wiener[48]的構思中:一個時間序列模型的預測效果如果通過加入另外一個時間序列的相關信息而得到改善,說明后者對于前者有“因果影響”。Granger[49]進而在線性回歸模型背景下將其嚴格化,認為一般的時間序列會在一定頻率范圍內發生振動,因此,“因果關系”的“譜表示”尤其重要,為因果關系分析研究奠定了較好的基礎,Granger于2003年獲得諾貝爾獎[50]。在此基礎上,Pearl等[51]將因果分析、圖模型及結構方程進行了綜合分析與應用。筆者研究團隊基于錢學森先生的開放復雜巨系統、Prigogine的耗散結構理論以及Haken的協同理論,充分考慮中藥復方成分、內源性物質、代謝產物體內變化的時間因素,專注于對生物樣本體內代謝的動態數據(時間序列)進行分析,將靜態相關性變為時間序列之間動態相關性,以因果關系為切入點,捕捉序列間的單向以及互為因果關系,變無方向的相關性為有方向的因果相關,構建了一套因果相關數理模型辨識技術,從而辨識“藥物-機體”協同起效的物質基礎。運用此模型研究開展了復方丹參方體內代謝研究,并確證了體內的核心效應成分丹參素異丙酯(3-(3,4-二羥基苯基)-2-羥基丙酸異丙酯,isopropyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate, IDHP)[52]。

4 筆者研究團隊對于藥物-機體復雜巨系統的思考及創新藥物研發

創新藥物是解除疾病、保障人類健康的主要途徑,中藥具有完整的理論體系、確切的臨床效果和悠久的應用歷史,在疾病治療及預防方面發揮了不可估量的作用。隨著經濟全球化、科技進步和現代醫學的快速發展,我國中醫藥也進入快速發展階段,黨中央、國務院把中醫藥發展上升為國家戰略并指出,要圍繞國家戰略需求及中醫藥重大科學問題,加快中藥新藥創制研究。中醫藥的“創智創新”,具有后續研究和開發應用價值,中醫藥已成為創新藥物研究與開發的重要源泉。

筆者研究團隊開展了20余年的中藥復方體內效應物質及創新藥物研究。面對上述藥物-機體復雜巨系統,筆者研究團隊先后提出了“君-使”對藥、“良關系”藥對等新思路[53],馭繁就簡地進行中藥復雜體系研究;同時發展了化學分子辨識、數理模型辨識、藥理功能辨識及臨床功效為一體的中藥有效成分群辨識技術,以推動中藥復方-機體復雜體系的分子化、數字化、信息化;更為重要的是,筆者研究團隊基于中醫藥君臣佐使配伍理論及西醫藥優勢,提出了“組合中藥分子化學”[54]及“合策略”創新藥物分子設計新思路,將中藥原成分數據、人體物質數據、數字化、代謝數據信息化,形成君、臣、佐、使分子庫集群,運用化學結構-構效辨識、臨床方證-功效辨識技術,合成出抗腦缺血化合物丹參素冰片酯(DBZ)[55]、新型抗高血壓221S系列化合物[56]以及抗癲癇93S系列化合物[57],前期研究發現,以上化合物均呈現活性好、機理明晰、易于制備、工藝可控、高效、安全等特點[58-60]。上述新藥候選化合物陸續獲得“十一五” “十二五”“十三五”國家新藥創制重大專項的資助、入庫與候選(見圖2)。

圖2 藥物-機體復雜巨系統中創新藥物的發現和設計思路Fig. 2 Discovery and design of innovative drugs from the giant complex drug-organism systemTCM: Traditional Chinese Medicine.

以抗心肌缺血1類創新藥物丹參素異丙酯為例,復方丹參方[61]作為藥典名方,由丹參、三七、冰片三味藥組成。丹參活血化瘀通經止痛為君藥,三七補益氣血為臣藥,冰片引經報使為佐使藥,三藥組方,共奏益氣活血、標本兼治之功效,用于冠心病、心絞痛等治療。筆者研究團隊運用LC-MS等代謝組學方法對復方丹參方及其中抽提出的“丹參-冰片”“良關系”之君-使對藥開展了體內代謝及效應物質研究,從而辨識出復方丹參方及丹參-冰片等藥對體內代謝效應物質丹參素異丙酯,并與江蘇漢邦科技有限公司聯合申報了國家重大科學儀器設備開發專項“超臨界流體色譜儀的研制與應用開發”,承擔應用超臨界流體色譜進行中藥組方及其代謝物的研究,完成了丹參素異丙酯及其原料丹參素的手性分離與分析。進而筆者研究團隊[62-64]對該化合物進行了受體色譜功能辨識及抗心腦缺血藥理功能辨識,發現其能夠保護缺氧復氧的大鼠離體心肌、可明顯減輕異丙腎上腺素誘導的心臟纖維化、具有顯著改善異丙腎上腺素誘導的心臟重構作用等,可作為心肌缺血等機制引起的高血壓、冠心病、心律失常、心衰、瓣膜病、心肌梗死、哮喘及抗高原缺氧等適應癥的藥物開發。同時,與江南大學蔡宇杰教授合作,利用合成生物學技術與化學合成,開發出單一手性IDHP的制備方法,解決了化學合成法成本高、拆分難度大等問題[65]。

5 結語

百年色譜與千年中醫藥的相逢是歷史長河的偶然,卻也是科學技術與哲學藝術融合的必然,色譜及其聯用技術在中醫藥產業鏈各環節中均做出了卓越的貢獻,對于中醫藥的“四化”即分子化、數字化、信息化、現代化意義重大,極大地推動了中醫藥與國際的接軌。中醫藥理論和中藥產業發展有其自身的特殊性,中醫藥現代化必須同時解決“繼承”“發展”與“創新”的難題,才能滿足中藥現代化、國際化對中藥新藥創制的基本要求。因此中醫藥現代化任重道遠,分析學人仍需負重前行。

“當下是‘兩個一百年’奮斗目標的歷史交匯點”,科技創新勁頭強勁,色譜工作者正處于當今中國百年未有之大變局的宏大歷史背景,應搶抓全球科技發展先機,努力發展色譜領域基礎前沿技術,突破傳統中醫藥現代化困境,以繼承構筑中醫藥根本,以創新提升產品質量,以規范促進產業發展,以創智有中國特色的高效創新藥物為目標,堅持面向世界科技前沿、面向經濟主戰場、面向國家重大需求、面向人民生命健康,不斷向科學技術廣度和深度進軍。