高效液相色譜法同時測定骨炎消方中8種有效成分的含量

李田洋，楊婷婷，張琪，王寶娟，鄭曙光*（.貴州中醫藥大學，貴陽 55005；.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴陽 55000）

骨炎消方為貴州中醫藥大學第一附屬醫院臨床經驗方，由狗脊、透骨香、飛龍掌血、蜘蛛香、大血藤、小血藤、黑骨藤、雞血藤、伸筋草、骨碎補、杜仲、淫羊藿等12 味藥材組成，具有消腫止痛、祛風除濕、舒筋活絡、通氣散血的功效。臨床常用來治療骨性關節炎、股骨頭壞死等疾病，療效顯著[1-4]。方中大血藤、小血藤、黑骨藤、雞血藤為藤本類植物，苗醫認為這類植物細長蔓延與人體的筋脈相似，大都具有舒通筋脈和通氣散血的作用[5]。雞血藤具有補血的功用[6]，為軟骨提供所必須的物質；杜仲、狗脊能補腎強骨，狗脊還可祛風除濕；蜘蛛香、透骨香能祛風除濕、表出毒邪，使機體祛除“外毒內亂”，恢復正常的狀態，蜘蛛香還能理氣和中、調理脾胃，使氣血能夠得到不斷的補充；飛龍掌血、伸筋草舒筋活絡、祛風除濕、消腫解毒；淫羊藿、骨碎補補腎強骨，活血止痛。諸藥合用，既能調節內亂，排除毒素又能打通筋脈，提供氣、血，達到治愈疾病的目的。

本課題組前期已進行骨炎消方制備工藝及臨床療效研究[7-9]，尚未見其有效成分含量測定的報道。為了更有效地控制骨炎消方的質量，提高臨床療效，本研究建立HPLC 法同時測定骨炎消方中原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯等8 種成分的含量，以期為骨炎消方的質量評價提供科學依據，同時為民族民間驗方藥物制劑的進一步研發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；超聲波清洗器（上海喬躍電子有限公司，JOYN-10A）；水浴鍋（上海雙捷實驗設備有限公司，DRHH-S8）；萬分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E）；十萬分之一天平（日本島津公司，ADW120D）；循環水式多用真空泵（鄭州科達機械儀器設備有限公司，SHZ-111）。

1.2 試藥

狗脊（批號：190501）、大血藤（批號：190301）、小血藤（批號：190601）、雞血藤（批號：200301）、伸筋草（批號：190701）、骨碎補（批號：200401）、杜仲（批號：200501）、淫羊藿（批號：191101）飲片（購自貴州同濟堂中藥飲片有限公司、貴陽德昌祥藥業有限公司、貴陽同仁堂藥店）；飛龍掌血、蜘蛛香、黑骨藤、透骨香均（購自貴陽市萬東橋藥材市場），以上藥材均經貴州中醫藥大學藥學院王波講師鑒定為正品。原兒茶酸（批號：H21J9Z64031）、綠原酸（批號：Y20A11K111541）、原兒茶醛（批號：TO1013FB14）、咖啡酸（批號：W16O10B100366）、表兒茶素（批號：K19J9R66088）、柚皮苷（批號：24N9Z75896）、淫羊藿苷（批號：T05D9B76755）、茴芹內酯（批號：Y01025SB14）對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；乙腈（色譜純，TEDIA 天地試劑公司）；甲醇（色譜純）、磷酸（優級純）（國藥集團化學試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用AgilentSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～15 min，18%A；15 ～16 min，19%A；16 ～30 min，33%A；30 ～33 min，35%A；35 ～50 min，48%A）， 流速：0.8 mL·min－1；檢測波長：270 nm；柱溫：28℃。在此條件下，8 種成分分離度較好（見圖1）。

圖1 混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution （A）and sample solution（B）

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度分別 為0.382、0.264、0.182、0.292、0.16、0.298、0.494、0.846 mg·mL－1的對照品儲備液，精密吸取各對照品儲備液1.0 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取12 味藥材各15 g，加8 倍量水，浸泡2 h后煎煮1 h，濾過，保留濾液Ⅰ；藥渣再加入6 倍量的水，煎煮2 次，每次0.5 h，濾過，得濾液Ⅱ；將濾液Ⅰ和濾液Ⅱ合并，攪拌，使其混合均勻后加熱濃縮成浸膏，制作成浸膏干粉備用。取骨炎消浸膏干粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密稱取對照品原兒茶酸4.012 mg、綠原酸3.134 mg、原兒茶醛2.216 mg、咖啡酸2.564 mg、表兒茶素1.786 mg、柚皮苷3.467 mg、淫羊藿苷5.751 mg、茴芹內酯6.847 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中加甲醇至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以質量濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，結果表明各化合物在相應范圍內與峰面積線性關系良好，見表1。

表1 各種成分的線性關系Tab 1 Linearity of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續測定6 次，計算原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯色譜峰峰面積的RSD（n＝6）分別為1.5%、0.76%、1.6%、1.4%、1.5%、1.4%、1.4%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h 進樣，測得原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯色譜峰峰面積RSD分別為1.9%、1.7%、1.4%、1.1%、1.9%、0.51%、1.3%、0.18%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯含量的RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%、1.2%、0.79%、1.9%、0.81%、2.9%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 精密稱定同一批骨炎消方浸膏粉粉末6 份，各約1 g，分別精密加入混合對照品溶液（原兒茶酸1.1005 mg·mL－1、綠原酸0.9546 mg·mL－1、原兒茶醛0.4112 mg·mL－1、咖啡酸0.1708 mg·mL－1、表兒茶素0.1597 mg·mL－1、柚皮苷0.9963 mg·mL－1、淫羊藿苷0.8225 mg·mL－1、茴芹內酯0.1224 mg·mL－1）各1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結果8 種成分的平均回收率在97.4%～100.4%，RSD在0.72%～2.9%，符合方法學要求。

2.4.6 樣品的含量測定 按“2.3”項下方法制備6批供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果(mg·g－1，n ＝6)Tab 2 Content determination of various constituent (mg·g－1，n ＝6)

根據《中國藥典》2020年版一部[10]相關藥材質量標準與6 批藥材測得結果，暫定每1 g 骨炎消方浸膏中含原兒茶酸不少于1.15 mg、綠原酸不少于0.95 mg、原兒茶醛不少于0.38 mg、咖啡酸不少于0.15 mg、表兒茶素不少于0.15 mg、柚皮苷不少于0.95 mg、淫羊藿苷不少于0.68 mg、茴芹內酯不少于0.085 mg。

3 討論

3.1 指標成分的確定

骨炎消方為民間收集的驗方，對其研究主要集中在臨床應用[8-9]及單味藥材的報道[11-17]，尚未建立質量控制標準。骨炎消方中狗脊、杜仲、伸筋草、蜘蛛香、黑骨藤含有的苯丙素類（綠原酸、咖啡酸）和酚類化合物（原兒茶酸、原兒茶醛）具有抗炎、抗風濕、鎮痛作用[11，14，18-21]；大血藤、透骨香具有良好的抗炎、止血、鎮痛作用，其主要活性成分為綠原酸[22-24]；雞血藤中主要藥效成分為黃酮類（表兒茶素），具有抗關節炎、改善血液循環等藥理作用[25]。骨碎補指標成分柚皮苷有抗炎、改善骨代謝作用，可促進成骨細胞增殖分化[26]；淫羊藿中的淫羊藿苷可調節骨代謝平衡以增強骨密度及強度，同時可促進微血管修復以改善股骨頭局部血供[27]；飛龍掌血中豐富的香豆素類（茴芹內酯）成分對風濕性關節痛、出血等有良好的治療作用[28]。結合骨炎消方臨床上主要用于治療骨性關節炎、類風濕關節炎、股骨頭壞死等疾病，因此，選取原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯作為指標成分。

3.2 色譜條件優化

本研究考察了甲醇-0.1%磷酸-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-水的流動相體系及25℃、28℃和30℃三個柱溫，當流動相為乙腈-0.1%磷酸水，柱溫為28℃時，分離度好，峰形好，基線穩定。比較了30%甲醇、60%甲醇、90%甲醇和甲醇的提取效果，結果甲醇提取效率高，雜質干擾小，峰形良好。研究了檢測波長為210 nm、254 nm、270 nm和310 nm 的色譜峰情況，當波長為270 nm 時色譜峰分離情況良好，基線較平穩。

3.3 小結

本研究首次建立了HPLC 法同時測定骨炎消方中原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、表兒茶素、柚皮苷、淫羊藿苷、茴芹內酯的含量，結果準確可靠，重復性好，可用于骨炎消方及其相關制劑的質量控制與評價。