復方感冒靈顆粒多指標成分測定方法的建立及綜合質量評價

章澤恒，李鵬輝，曾文文，陳開義，吳艷，佘延驕，彭艷梅*（.湖南省藥品審評認證與不良反應監測中心，長沙 400；.湖南省中醫藥研究院，長沙 400；.三金集團湖南三金制藥有限責任公司，湖南 常德45000）

復方感冒靈顆粒由山銀花、野菊花、三叉苦、五指柑、南板藍根、崗梅6 味中藥和對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏3 種化藥制成的中西藥復方制劑，具有辛熱解表、清熱解毒的作用，主要用于治療感冒發熱、頭痛、咳嗽等癥狀。現行藥品標準中僅以薄層和滴定法對成品進行質量控制[1]，未對方中所含主要化學成分進行定性定量分析，且滴定法操作步驟相對繁瑣，重現性差，難以全面準確地控制該藥品質量。

目前針對復方感冒靈顆粒中3 種化藥成分含量的分析研究較多，或檢測1 種[2]或同時檢測3種[3-6]，但由于對乙酰氨基酚含量遠遠高于咖啡因和馬來酸氯苯那敏，同時檢測易引起相對誤差。本研究通過分析制劑處方中各有效成分[2-7]，著眼于對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和野菊花的指標性成分蒙花苷，將標示量較高的對乙酰氨基酚和咖啡因、馬來酸氯苯那敏分開檢測，將中藥成分蒙花苷單獨檢測，建立3 種定量分析方法，并對高效液相色譜法進行方法學驗證，通過綜合質量評價分析方法，對連續10 批大生產的復方感冒靈顆粒含量檢測數據進行統計分析，以考察成品質量的穩定性，該方法可為復方感冒靈顆粒的質量控制提供有益思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XPE-105 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Quintix224-1CN電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；TD2102 電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；HH 恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）；SB-5200D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 材料

蒙花苷（批號：111528-201710，含量：96.6%）、對乙酰氨基酚（批號：100018-201610，含量：99.9%）、咖啡因（批號：171215-201512，含量：99.9%）、馬來酸氯苯那敏（批號：100047-201507，含量：99.7%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Sigma 公司）；水為怡寶純凈水；其余試劑均為分析純。復方感冒靈顆粒（批號為200501 ～200510，規格：14 g/袋，三金集團湖南三金制藥有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 對乙酰氨基酚 色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水（含0.5%磷酸和0.4%三乙胺溶液）-乙腈（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：244 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。理論板數按對乙酰氨基酚峰計算應不低于3000。

2.1.2 咖啡因和馬來酸氯苯那敏 色譜柱：Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相：水（含0.5%磷酸和0.4%三乙胺溶液）-乙腈（93∶7）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：264 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按馬來酸氯苯那敏峰計算應不低于4000。

2.1.3 蒙花苷 色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：334 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。理論板數按蒙花苷峰計算應不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 對乙酰氨基酚 精密稱取對乙酰氨基酚對照品適量，加水制成103.2966 μg·mL－1的對照品儲備液，再稀釋得41.3186 μg·mL－1的對照品溶液。精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置5 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，作為系列對照品溶液。

2.2.2 咖啡因和馬來酸氯苯那敏

① 咖啡因：精密稱取咖啡因對照品適量，加流動相制成106.4934 μg·mL－1的對照品儲備液。分別精密量取咖啡因對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置5 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度作為系列對照品溶液。

② 馬來酸氯苯那敏：精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品適量，加流動相制成45.1442 μg·mL－1的對照品儲備液。分別精密量取馬來酸氯苯那敏對照品儲備液1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL置10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為系列對照品溶液。

另外，精密稱取咖啡因、馬來酸氯苯那敏對照品適量，加流動相制成質量濃度分別為44.6553、40.1791 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2.3 蒙花苷 精密稱取蒙花苷對照品適量，加甲醇制成135.4332 μg·mL－1的對照品儲備液，再稀釋得到27.0886 μg·mL－1的對照品溶液。分別精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為系列對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 對乙酰氨基酚 取本品適量，研細，取約5.0 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加入流動相適量，超聲（300 W，40 kHz）處理10 min，取出放冷，加流動相定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL 置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.2 咖啡因和馬來酸氯苯那敏 取本品適量，研細，取約2 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加入流動相適量，超聲（300 W，40 kHz）處理30 min，取出，放冷，加流動相定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 蒙花苷 取本品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲（300 W，40 kHz）處理30 min，取出放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按復方感冒靈顆粒處方和制備工藝分別制備缺對乙酰氨基酚、缺咖啡因和馬來酸氯苯那敏、缺野菊花的陰性樣品，并分別按“2.3”項下方法制成3 種陰性樣品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性 分別取對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏、蒙花苷的對照品溶液，供試品溶液，陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果見圖1，表明3 種測定方法下陰性樣品均無干擾。

圖1 復方感冒顆粒專屬性考察結果Fig 1 Specificity inspection of compound Ganmaoling granule

2.5.2 線性范圍 精密吸取“2.2”項下4 種線性溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

表1 4 種指標成分的線性范圍考察結果Tab 1 Linearity of 4 index components

2.5.3 精密度 取復方感冒靈顆粒供試品適量，按“2.3”項下方法制備3 種供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，記錄各峰面積，計算得到對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷峰面積RSD分別為0.71%、0.38%、0.81%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性 按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液6 份并測定。結果對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷含量平均值分別為10.76、0.85、0.19、0.52 mg·g－1，RSD分別為1.8%、1.1%、3.5%、0.42%，表明方法重復性良好。

2.5.5 中間精密度 按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液6 份并測定，考察不同設備、不同日期、不同分析人員條件下的中間精密度。結果12 份供試品的對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷含量平均值分別為10.74、0.85、0.18、0.53 mg·g－1，RSD分別為0.23%、0.72%、6.8%、2.0%，表明方法中間精密度良好。

2.5.6 穩定性 取“2.5.3”項下各供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進行測定，記錄各峰面積。結果對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷峰面積RSD分別為0.32%、0.45%、0.85%、0.20%，說明供試品溶液在8 h 內穩定性良好。

2.5.7 加樣回收試驗

① 對乙酰氨基酚：取同一批號已知含量的復方感冒靈顆粒9 份，按樣品中已知含量的50%、100%、150%加入對照品適量，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液（取樣量減半），進樣測定。

② 咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷：分別配制質量濃度為1283.715、285.5408、474.4992μg·mL－1的咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷對照品溶液。取同一批號已知含量的復方感冒靈顆粒9 份，按樣品中已知含量的50%、100%、150%加入對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備各供試品溶液（取樣量減半），進樣測定。

結果對乙酰氨基酚低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為100.67%（RSD＝0.85%）、98.02%（RSD＝1.6%）、97.08%（RSD＝0.63%）；咖啡因低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為104.37%（RSD＝0.71%）、104.03%（RSD＝0.81%）、104.25%（RSD＝0.80%）；馬來酸氯苯那敏低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為100.92%（RSD＝3.2%）、102.61%（RSD＝1.9%）、102.16%（RSD＝0.50%）；蒙花苷低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為102.01%（RSD＝3.8%）、100.14%（RSD＝1.8%）、97.30%（RSD＝0.96%）。

2.6 樣品含量測定結果

取10 批復方感冒靈顆粒，制備供試品溶液，進樣測定，記錄各峰面積，計算樣品中對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷的含量，結果見表2。

表2 10 批復方感冒靈顆粒的含量測定結果(mg·g－1，n ＝2)Tab 2 Content determination of 10 batches of compound Ganmaoling granules (mg·g－1，n ＝2)

復方感冒靈顆粒規格為14 g/袋，其中對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏的標示量分別為168 mg、11.998 mg、2.674 mg。從表2的結果可知，實測每袋含對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏的均值為170.57 mg、12.38 mg、2.58 mg，分別為標示量的101.53%、103.21%、96.48%。符合標準中對乙酰氨基酚、咖啡因應為標示量的85%～115%、馬來酸氯苯那敏應為標示量的80%～120%的要求。標準中規定每袋含蒙花苷不得少于3.96 mg，從表2的10 批含量測定結果可知，實測每袋蒙花苷含量在7.07 ～8.46 mg，均符合要求。

2.7 綜合質量評價分析

采用SPSS 18.0 軟件，將對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和蒙花苷含量測定結果進行主成分分析[8-9]，提取特征值≥1 的前兩個主成分，方差的累積貢獻率達到73.547%，說明能代表原始數據大部分的信息。主成分的主要信息見表3，X1～X4分別代表對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、蒙花苷的含量。

表3 主成分的特征值、方差累積貢獻率和特征向量值Tab 3 Eigenvalue，variance accumulated contribution rate，and eigenvector of principal component analysis

根據特征向量，得到兩個主成分的線性組合表達式為：

Z1＝－0.812X1＋0.853X2－0.033X3＋0.636X4

Z2＝－0.423X1－0.109X2＋0.978X3－0.054X4

再以每個主成分的貢獻率作為權數，構建綜合評價函數：

f＝0.460 32Z1＋0.275 15Z2

將每個樣品的主成分得分計算出后，代入綜合評價函數，計算f值。10 批復方感冒靈顆粒f值分別為－5.32、－5.34、－5.32、－5.36、－5.26、－5.30、－5.39、－5.69、－5.76、－5.74，均值為－5.45，RSD為3.7%。綜合質量評價函數結果表明10 批大生產復方感冒靈顆粒質量穩定可控。

3 討論

3.1 流速的選擇

分別在0.9、1.0、1.1 mL·min－1（柱溫均為30 ℃）流速下進行耐用性考察，結果表明流速對3 種含量測定方法均無明顯影響，因此流速均選擇液相的普適條件1.0 mL·min－1。

3.2 柱溫的選擇

分別在25、30、35℃（流速均為1.0 mL·min－1）柱溫下進行耐用性考察，結果表明柱溫對蒙花苷、對乙酰氨基酚含量測定無明顯影響，而在35℃時，馬來酸氯苯那敏與雜質峰分不開，因此柱溫選擇液相的普適條件30℃。

3.3 小結

本研究建立了復方感冒靈顆粒中對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和蒙花苷4 種指標成分含量測定方法，方法學考察表明專屬性、重現性、穩定性等均較好，以這4 種指標成分檢測數據作為評價依據，采用客觀賦權評價法進行綜合質量評價分析，根據指標之間的相關關系和各項指標的變異系數來確定權重，避免人為的主觀因素干擾，能更加客觀地評價復方感冒靈顆粒的整體質量[10-11]。