超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定東北紅豆杉中7種黃酮的含量

彭波，李洪權(quán)，柏玉冰*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 40007；.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲4000）

東北紅豆杉（Taxus cuspidataSieb.et Zucc.）又名紫杉，是紅豆杉科紅豆杉屬植物[1]，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)白山系[2]。成分研究表明東北紅豆杉含有紫杉烷、黃酮、甾體、木質(zhì)素[3]等成分；藥理活性研究表明東北紅豆杉有抗腫瘤[4-5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等藥理作用。

目前，關(guān)于東北紅豆杉的研究大多圍繞其紫杉烷類成分的抗腫瘤活性[8-9]。但還有研究表明其黃酮類成分也有很好的生物活性[10-11]，如槲皮素[12]、山柰酚[13]和蘆丁[14]的抗腫瘤活性，銀杏雙黃酮對(duì)高糖致微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用[15]，金松雙黃酮對(duì)尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的抑制作用[16]，二氫槲皮素的心臟保護(hù)作用[17]以及二氫山柰酚對(duì)脂質(zhì)沉積的抑制作用[18]等。

基于這些黃酮類功效成分對(duì)東北紅豆杉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)其建立含量測(cè)定方法則顯得尤為重要。Gai 等[19]測(cè)定了金松雙黃酮、銀杏雙黃酮和槲皮素成分的含量。目前尚未發(fā)現(xiàn)山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁4 種成分含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道，更未發(fā)現(xiàn)對(duì)這7 種成分同時(shí)測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。

目前中藥材中黃酮類成分的含量測(cè)定方法有比色法、薄層色譜法、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[20]。而鑒于本法測(cè)定成分多達(dá)7 種，對(duì)檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性的要求均較高，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）具有基于質(zhì)荷比分析而幾乎不依賴于各峰之間的分離度（同分異構(gòu)體除外），分析時(shí)間短，靈敏度高等特點(diǎn)[21]。本研究基于UHPLC-MS/MS 法建立東北紅豆杉中7 種黃酮成分的含量測(cè)定方法，以期為基于黃酮類成分對(duì)東北紅豆杉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)幫助。

1 材料

1.1 藥材

東北紅豆杉，獲取途徑為自采、網(wǎng)購(gòu)和藥材市場(chǎng)采購(gòu)，樣品信息見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所胡冠宇主管藥師鑒定均為紅豆杉科紅豆杉屬植物東北紅豆杉的帶葉枝條或全株。所有批次藥材（全株則剪取帶葉枝條）均經(jīng)粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，備用。

表1 東北紅豆杉樣品信息Tab 1 Information of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.samples

1.2 試藥

銀杏雙黃酮（純度：98.0%，批號(hào)：PRF911 0505）、金松雙黃酮（純度：98.0%，批號(hào)：PRF 9110541）、二氫槲皮素（純度：98.0%，批號(hào)：BP1367）和二氫山柰酚（純度：98.0%，批號(hào)：SBP00122）（對(duì)照品，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；槲皮素（純度：97.4%，批號(hào)：100081-200907）、山柰酚（純度：95.9%，批號(hào)：110861-200808）和蘆丁（純度：90.5%，批號(hào)：100080-200707）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲酸、乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾有限公司）。

1.3 儀器

電子天平（XSE 205DV，0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司）；超聲波儀（HNS-SY-150，40 kHz，400 W，北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜（上海愛博才思分析儀器有限公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～6 min，90%→65%A；6～8 min，65%→45%A；8 ～14.5 min，45%→30%A；14.5 ～20 min，30%A →10%A；20 ～20.5 min，10%→90%A；20.5 ～22 min，90%A）， 流速0.8 mL·min－1，采集時(shí)間22 min，柱溫30℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電離源：電噴霧電離源（ESI）；離子模式：通過(guò)比較正、負(fù)離子模式下各成分分子離子峰信號(hào)強(qiáng)度，選擇負(fù)離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度、電噴霧電壓、氣簾氣及離子源氣等參數(shù)則選擇儀器默認(rèn)參數(shù)，其中離子源溫度為550 ℃，電噴霧電壓為－4500 V，氣簾氣為35.0 psi，離子源氣1 為55 psi，離子源氣2 為55 psi；去簇電壓和碰撞能量，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度曲線，選擇各成分分子離子峰信號(hào)最強(qiáng)時(shí)所顯示數(shù)值，詳見表2。

表2 7 種黃酮的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UHPLC-MS/MS parameters of the 7 flavones

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 精密稱取不同質(zhì)量的銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁對(duì)照品，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，得各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為1.40、1.04、1.30、5.00、2.50、2.20、3.20 mg·mL－1。對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖Fig 1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of mixture reference

2.2.2 供試品溶液 取紅豆杉粉末（批號(hào)：YP20 200328，粉碎后過(guò)4 號(hào)篩），精密稱取細(xì)粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，稱量，超聲（400 W，40 kHz）提取20 min，靜置至室溫，再稱量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。東北紅豆杉樣品總離子流和提取離子色譜圖見圖2。

圖2 東北紅豆杉樣品總離子流和提取離子色譜圖Fig 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.sample

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用50%甲醇稀釋得系列濃度的混合對(duì)照品溶液（銀杏雙黃酮：0.140 ～14.0 μg·mL－1；金松雙黃酮：0.208 ～20.8 μg·mL－1； 槲皮素：0.001 30 ～0.130 μg·mL－1；山柰酚：0.005 00 ～0.500 μg·mL－1； 二氫槲皮素：0.002 50 ～0.250 μg·mL－1；二氫山柰酚：0.0220 ～2.20 μg·mL－1； 蘆丁：0.320 ～ 32.0 μg·mL－1），進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算7 種成分的線性回歸方程，結(jié)果見表3，7 種成分在各自線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表3 線性關(guān)系結(jié)果(n ＝7)Tab 3 Linear regression of the 7 compounds (n ＝7)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁峰面積的RSD分別為0.76%、0.86%、0.72%、0.89%、0.84%、0.73%和0.76%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：YP20200328）6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁峰面積的RSD分別為1.1%、1.7%、1.0%、1.8%、1.3%、1.9%和1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品供試品溶液（批號(hào)：YP20200328），分別于0、2、4、8 和12 h 進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁峰面積的RSD分別為2.1%、2.1%、1.3%、1.4%、1.6%、1.5%和1.7%，表明供試品溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：YP20200328）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入適量對(duì)照品溶液后，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁的平均回收率為98.9%、100.7%、99.0%、99.3%、98.8%、101.7%和100.1%，RSD分 別 為1.0%、2.4%、1.7%、1.8%、1.7%、1.1%和2.3%，表明本方法回收率良好。

2.4 樣品測(cè)定

精密稱取8 批次不同批號(hào)的東北紅豆杉各兩份，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算7種成分含量，結(jié)果見表4。

表4 8 批次樣品中7 種黃酮的含量(μg·g－1，n ＝2)Tab 4 Contents of the 7 flavones in 8 batches of samples (μg·g－1，n ＝2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件優(yōu)化

本研究考察了不同的提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇），提取體積（30、40、50 mL），提取時(shí)間（10、20、30 min），以7 種黃酮的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定當(dāng)用40 mL 50%甲醇提取20 min 時(shí)，7 種黃酮的峰面積均達(dá)到最大值。

3.2 色譜條件優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 比較了兩種色譜柱，Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以7種黃酮的分子離子峰的保留性和峰形等因素為判斷依據(jù)，結(jié)果兩款色譜柱均獲得了較為合適的保留時(shí)間和較好的峰形。但使用Thermo Acclaim 120 C18柱時(shí)，二氫槲皮素和二氫山柰酚稍有前延峰。因此，選擇Welch Xtimate C18色譜柱。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇 比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果，當(dāng)選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí)，二氫槲皮素出現(xiàn)前延峰；當(dāng)選擇乙腈-水和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液時(shí)，峰形均對(duì)稱，且各峰均完全分離。進(jìn)一步對(duì)3 種不同流動(dòng)相系統(tǒng)下的7 種黃酮成分的峰面積進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇乙腈-水時(shí)各成分峰面積均最大。

3.3 總結(jié)

本研究建立了東北紅豆杉中銀杏雙黃酮、金松雙黃酮、槲皮素、山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚、蘆丁7 種黃酮類成分的UHPLC-MS/MS含量測(cè)定方法，其中山柰酚、二氫槲皮素、二氫山柰酚和蘆丁的含量測(cè)定方法在東北紅豆杉中均為首次建立。本法為基于黃酮類成分對(duì)東北紅豆杉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了技術(shù)支持。