高效液相色譜法測定拉莫三嗪片中的有關物質

姜金生，石笑弋，劉軼*，歐陽冬生，陳俊，陳開義，胡杰（.三金集團湖南三金制藥有限責任公司，湖南 常德 4500；.湖南省藥品檢驗研究院（湖南藥用輔料檢驗檢測中心），長沙 4000；3.中南大學湘雅醫院臨床藥理研究所，長沙 4000；4.復雜基質樣本生物分析湖南省重點實驗室，長沙 40000）

拉莫三嗪（lamotrigine）是新一代的抗癲癇藥，在臨床上可單獨使用也可聯合使用治療癲癇，療效顯著，基本上沒有致畸性。臨床上拉莫三嗪還可用于雙相情感障礙的治療，安全性較好[1]。在合成拉莫三嗪原料藥中可能引入工藝雜質，比如2，3-二氯苯甲酰氯、2，3-二氯苯甲酰氰、2，3-二氯苯甲酸（拉莫三嗪雜質I，文中稱為雜質B）等，在拉莫三嗪制劑儲存過程中可能產生一些降解雜質，如2，3-二氯苯甲酸（雜質B）、3-氨基-6-（2，3-二氯苯基）-1，2，4-三嗪-5-（4H）-酮（雜質C）、6-（2，3-二氯苯基）-1，2，4-三嗪-3，5-（2H，4H）-二酮（雜質E）等（見表1）。目前關于這些雜質檢測方法的文獻報道不多[2-3]，且各國藥典與國內標準對雜質的命名各不相同。

表1 拉莫三嗪片有關物質Tab 1 Related impurity in lamotrigine tablets

英國藥典（BE2018）[4]與歐洲藥典（EP9.0）[5]中拉莫三嗪原料藥與片劑的檢測方法相同，均采用兩個不同的液相色譜方法分別測定拉莫三嗪的有關物質，美國藥典（USP41）[6]對拉莫三嗪原料藥與片劑的有關物質采用不同的液相色譜方法分別偏重于工藝雜質與降解雜質的檢測。黃諾哲等[7]在EP9.0 的基礎上，把150 mm 長度的色譜柱改為250 mm 色譜柱同步改變洗脫持續時間并采用雙波長的高效液相色譜方法，該方法雖能同時檢測雜質B、雜質C、雜質D，但對BP 藥典中雜質G 與某氧化降解雜質的分離度不理想，工藝雜質2，3-二氯苯甲酰氰、2，3-二氯苯甲酰氯和可能的降解雜質E 未見檢測報道。Emami 等[8]以高效液相色譜等度洗脫的方法能同時檢測雜質C和雜質D，但對雜質B、雜質E 以及工藝雜質等未能有效檢出。文獻采用以甲醇-0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH 值至4.0）為流動相的高效液相色譜等度洗脫法對拉莫三嗪片進行有關物質檢測[2-3]，與企業標準[9-10]一樣，由于流動相pH 值相同，雜質B 與拉莫三嗪主峰分離不好，雜質D與雜質E 出峰時間在100 min 左右，不能有效對拉莫三嗪有關物質進行同時檢測。

本文在企業標準YBH0245 2014[9]、WS1-（X-119）-2012Z[10]、YBH04392010[11]的基礎上結合國內外拉莫三嗪相關質量標準以及文獻報道[2-7]，參照《中國藥典》2020年版四部[12]、《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》[13]和《化學藥物雜質研究技術指導原則》[14]，進一步開發出能同時檢測可能的工藝雜質和降解雜質的高效液相色譜方法，并對主要控制雜質進行相對保留時間和校正因子研究，為拉莫三嗪原料藥與制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

MS205DU 十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司）；LC-20A 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PHSJ-4F pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.2 試藥

拉莫三嗪片（批號：181208、181209、181210，自制）；拉莫三嗪對照品（批號：100775-201902，中國食品藥品檢定研究院，純度：99.7%）；雜質B（拉莫三嗪雜質I）對照品（批號：510086-201401，中國食品藥品檢定研究院，供有關物質檢測用）；拉莫三嗪雜質C 對照品（批號：F3L329，USP，供有關物質檢測用）；2，3-二氯苯甲酰氯（批號：170037，自制）；2，3-二氯苯甲酰氰（雜質F，批號：1703007，自制）；縮合物（雜質A1，批號：10901-1806005y，自制）；拉莫三嗪雜質D 對照品（批號：F1H279，USP，供有關物質檢測用）；拉莫三嗪雜質E 對照品（批號：L2011011，U.K，供有關物質檢測用）；甲醇（色譜純，TEDIA）、磷酸（色譜純）、三乙胺（色譜純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、30% 過氧化氫（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；純化水（自制）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 為甲醇，流動相B 為 0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH 值至4.5），梯度洗脫（見表2）；流速為0.8 mL·min－1；檢測波長為230 nm；柱溫為40℃；進樣量為20 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取本品細粉適量（相當于拉莫三嗪約20 mg），精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加入稀釋液（甲醇-0.1 mol·L－1鹽酸溶液＝20∶80，V/V）適量，制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加稀釋液定量稀釋制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.8 μg 的溶液，作為對照溶液。

2.2.3 空白溶劑 以稀釋液作為空白溶劑。

2.2.4 對照品儲備溶液 分別稱取拉莫三嗪、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質A1、雜質F 自制對照品適量，精密稱定，加甲醇適量溶解，再以稀釋液稀釋成適當濃度的溶液，作為對照品儲備溶液。

2.2.5 系統適用性溶液 取拉莫三嗪約10 mg，加適量6 mol·L－1氫氧化鈉溶液，置90℃加熱約1 h，用6 mol·L－1鹽酸溶液中和，再加入10 mL 雜質B 對照品溶液（精密稱取雜質B 對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL－1）和雜質E 對照品溶液約2 mL（精密稱取雜質E 對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL－1），用稀釋液稀釋至每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg、雜質B 0.04 mg、雜質E 0.008 mg 的混合溶液，作為系統適用性溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 系統適用性試驗 取系統適應性溶液及空白溶劑，空白輔料溶液按“2.2.1”項下方法制備，進樣測定，記錄色譜圖，雜質B、拉莫三嗪、雜質C、雜質E 依次出峰，分離度符合要求，拉莫三嗪理論塔板數不低于5000，雜質B 峰相對保留時間約為0.8，與拉莫三嗪峰分離度達到1.5，相對保留時間1.0 ～2.0 的雜質C（主要降解雜質）的相對保留時間約為1.7，系統適應性良好（見圖1）。

圖1 系統適應性色譜圖Fig 1 Chromatogram of system suitability test

取雜質A1、雜質D、雜質F 對照品儲備液用稀釋液稀釋至適當濃度后按“2.1”項下條件測定，結果各雜質出峰時間分別約為46.61、48.96、50.36 min，分離度均大于6.5，能較好地檢測分離。

2.3.2 破壞性試驗

① 未破壞：取拉莫三嗪片（規格：50 mg，批號：181208）按“2.2.1”項下方法配制未破壞溶液。

② 酸、堿破壞：分別取本品粉末適量（約相當于拉莫三嗪20 mg），精密稱定，分別加入1 mL 6 mol·L－1鹽酸溶液或6 mol·L－1氫氧化鈉溶液，90℃水浴加熱分別約3 h（酸破壞）和1 h（堿破壞），放冷至室溫，取6 mol·L－1氫氧化鈉溶液或6 mol·L－1鹽酸溶液中和，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續濾液作酸、堿降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

③ 氧化破壞：取本品粉末適量（約相當于拉莫三嗪20 mg），精密稱定，加入30%過氧化氫溶液1 mL，90℃水浴加熱約1 h，放置室溫，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續濾液作氧化降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

④ 光照、高溫破壞：分別取本品粉末適量，分別置105℃烘烤8 h、（4500±500）Lx 強度下光照3 d，精密稱取細粉適量（約相當于拉莫三嗪20 mg），加適量稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續濾液即得光照、高溫降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

取上述各溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結果空白輔料不干擾主成分峰、特定雜質峰的檢測。拉莫三嗪峰與雜質B 和雜質C 分離較好。在高溫、光照條件下，拉莫三嗪片較穩定，在酸、堿、氧化條件下所產生雜質均能與主峰良好分離，不干擾本品有關物質的測定（見圖2）。

圖2 樣品破壞性試驗色譜圖Fig 2 Chromatogram of sample destruction test

2.4 相對保留時間

分別精密移取對照品儲備液適量，加稀釋液稀釋成每1 mL 約含雜質B、雜質C 和拉莫三嗪均為0.5 μg 的混合液。對雜質B、雜質C 相對拉莫三嗪的保留時間在不同色譜柱[Welch、thermo、Agela、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進行研究，雜質B 相對拉莫三嗪主峰保留時間（RRT）較穩定，均為0.8；雜質C 相對拉莫三嗪RRT 在1.5 ～1.7，其中Agela 色譜柱和Kromasil色譜柱的RRT 均為1.7。考慮到不同色譜柱對雜質C 的相對保留時間有一定的影響，對同一品牌（Kromasil）不同批次填料（色譜柱1 和色譜柱2）及不同序列號的色譜柱（色譜柱2 和色譜柱3）進行試驗，結果雜質B 和雜質C 的相對保留時間都較穩定，相對拉莫三嗪主峰RRT 約為0.8、1.7，同時以系統適應性溶液按“2.3.1”項下條件進行雜質定位與驗證。

2.5 線性關系與校正因子

根據“2.4”項下不同色譜柱考察結果，以Kromasil 色譜柱考察雜質B、雜質C 的校正因子。分別精密移取對照品儲備液適量，稀釋成一系列濃度的混合對照品溶液，取3 根不同色譜柱按“2.1”項下色譜條件進樣，結果雜質B、雜質C與拉莫三嗪質量濃度在0.5 ～5 μg·mL－1與峰面積呈較好的線性關系，計算拉莫三嗪相對于雜質B、雜質C 的校正因子F（F＝K雜質線性斜率/K拉莫三嗪線性斜率），結果雜質B 的平均校正因子為2.7，雜質C 的平均校正因子為1.4，結果見表3。

表3 雜質B、雜質C 和拉莫三嗪線性關系考察結果Tab 3 Linearity of impurity B，impurity C and lamotrigine

2.6 定量限和檢測限

取“2.2.4”項下對照品儲備溶液，精密移取對照品儲備液適量，再用稀釋液稀釋成適當濃度的對照品溶液，照“2.1”項下方法進樣。以信噪比（S/N）＝3 為檢測限，以S/N＝10 為定量限，結果拉莫三嗪、雜質B、雜質C 的定量限分別為3.9、9.1、10.6 ng；檢測限分別為1.3、2.7、3.3 ng。

2.7 穩定性試驗

取“2.2”項下供試品溶液和對照溶液于室溫下放置，另取雜質B、雜質C 對照品適量，精密稱定，加適量甲醇溶解并用稀釋液稀釋成每1 mL 約含0.8 μg 雜質B 和2 μg 雜質C 的混合溶液，于室溫下放置。供試品溶液于0、2、4.5、7、9.5、14、17.5、26 h 按“2.1”項下色譜條件分別進樣；對照溶液于0、2、4.5、7、9.5、17.5、23.5、26 h 分別進樣測定，雜質B 和雜質C 的混合溶液于0、2、4.5、6、8、10.5、13、19.5 h 分別進樣測定。結果供試品溶液、對照溶液放置26 h，拉莫三嗪峰面積RSD分別為0.050%、1.7%，穩定性均較好。雜質B、雜質C 溶液放置19.5 h，峰面積RSD分別為0.90%、0.60%，穩定性均較好。

2.8 精密度與準確度

2.8.1 精密度試驗 按“2.2”項下方法配制供試品溶液和對照溶液各 6 份，另取對照品儲備溶液適量，分別加稀釋液稀釋成每1 mL 含雜質B 約0.8 μg、雜質C 約2 μg 的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果供試品溶液拉莫三嗪、對照溶液拉莫三嗪、對照品溶液中雜質B 和雜質C 的保留時間和峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.8.2 中間精密度試驗 由不同操作人員在不同時間和不同儀器分別按“2.8.1”項下方法測定，結果各成分峰面積RSD均小于2.0%，表明本法的中間精密度較好。

2.8.3 雜質回收試驗與重復性 稱取9 份拉莫三嗪片細粉（約相當于拉莫三嗪20 mg），置50 mL量瓶中，加適量稀釋液溶解，再分別加每1 mL含雜質B 約 0.8 μg，雜質C 約2 μg 的對照品溶液1、2、3 mL（相當于雜質對照品溶液濃度的50%、100%、150%），各3 份，加入稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算回收率并考察方法的重復性，結果各已知雜質回收率均滿足0.1%雜質限度的回收率范圍（90%～108%），回收率及重復性RSD均在5%以內，說明該方法的準確度及重復性較好。

2.9 耐用性試驗

2.9.1 相對保留時間耐用性 取每1 mL 含雜質B約0.8 μg、雜質C 約2 μg、雜質E 0.4 μg 的對照品溶液，對流動相比例、柱溫、流速、鹽濃度、pH 值、色譜柱進行適當調整，考察方法的耐用性。結果表明主峰和各雜質峰均能達到良好的分離效果；雜質C 的相對保留時間主要受流動相的比例、柱溫、流動相pH 值的影響，雜質B 的相對保留時間受的影響均較少。從耐用性試驗的數據看，雜質B 和雜質C 的相對保留時間均較穩定，結果見表4。

表4 耐用性試驗結果匯總Tab 4 Summary of durability test

2.9.2 校正因子重現性 在確定好雜質B 和雜質C相對保留時間的基礎上進行了校正因子的研究。對比了3 個實驗室的方法學驗證與校正因子復核數據，發現在擬定的液相色譜條件下，流動相種類和初始比例、檢測波長、鹽濃度、經系統適應性溶液驗證后的儀器狀態和色譜柱對校正因子的賦值沒有明顯影響，該方法的校正因子重現性主要受流動相pH 值以及實驗員稱量對照品的細微偏差的影響，但各實驗室計算所得的校正因子數值均未高于本方法擬定的值，數據顯示雜質B 和雜質C 校正因子在流動相pH 值4.45 ～4.55 內相對穩定。

2.10 有關物質的檢查

照“2.1”項下方法，對3 批拉莫三嗪片長期穩定性（22 個月）考察樣品進行有關物質的測定，按“2.2”項下方法配制供試品溶液、對照溶液、空白溶液進樣測定，計算各雜質的含量、其他單個雜質的含量和雜質總量。結果3 批樣品的雜質檢查均符合規定，見表5。

表5 拉莫三嗪片中有關物質的檢測結果(%，校正因子法)Tab 5 Determination of related substances in lamotrigine tablets(%，calibration factor method)

3 討論

3.1 流動相pH 值的考察

前期研究中發現流動相為甲醇-0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH 值至3.0 ～5.0）時，拉莫三嗪與雜質B 分離度隨流動相pH 值增加而增大，流動相調節pH 值至4.2 ～5.0 時拉莫三嗪與雜質B的分離度在5.61 ～13.08，本文選擇pH 4.5 作為本方法流動相pH 值，能有效分離拉莫三嗪主峰與雜質B，且該pH 值條件下色譜柱的耐受性較好。

3.2 檢測波長的考察

通過對氧化降解樣品進行DAD 全波長掃描，發現在230 nm 波長處檢測的雜質個數較多且基線平穩，結合各已知雜質的紫外掃描圖，優選230 nm 作為本品有關物質的檢測波長。

3.3 破壞試驗方法的考察

拉莫三嗪在常規的高溫、光照條件下，未見明顯的雜質產生，說明拉莫三嗪在常規環境中相對較穩定。拉莫三嗪在加酸或堿的同時置90℃水浴中高溫破壞，能生成雜質C 和少量的雜質E，氧化降解雖然能夠同時產生雜質C、雜質B和少量的雜質E，但產生雜質C、雜質B 的量較少且氧化降解的產物復雜。本研究中以拉莫三嗪10 mg 加6 mol·L－1NaOH 溶液1 ～5 mL 置90 ℃水浴30 ～90 min 降解產生雜質C，放冷后用6 mol·L－1HCl 溶液中和，并加雜質B 對照品溶液的方法來制備系統適用性溶液，從而節省了從國外購買雜質C 的時間和成本。該系統適用性溶液可用于雜質B 和雜質C 相對保留時間的驗證，進而用于拉莫三嗪原料藥和制劑的有關物質分析。黃諾哲等[7]取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液3 mL 在80 ℃水浴15 min，色譜圖顯示可能氧化降解產生了少量的雜質D，本研究取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液1 mL 在90 ℃水浴1 h，在約49 min 雜質D 出峰處未見明顯出峰或低于檢測限，而在約37 min 處檢出了少量的雜質E。本研究與文獻報道不同[7]，可能是由于氧化降解試驗方法或者液相色譜檢測方法不同引起的。

3.4 雜質含量的限定

拉莫三嗪片長期穩定性樣品的檢測數據顯示雜質C 有增長趨勢，從0 個月時的未檢出到22 個月時檢出0.01%，但未檢出雜質E，最大單雜0.05%，總雜質0.06%，均符合企業制訂的質量標準和國外藥典標準，即雜質B（相對保留時間約0.8）按校正后的峰面積計算（乘以校正因子2.7），不得大于對照溶液主峰面積（0.2%）；雜質C（相對保留時間約1.7）按校正后的峰面積計算（乘以校正因子1.4），不得大于對照溶液主峰面積的2.5 倍（0.5%）；其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積（0.2%）；各雜質峰面積的和按校正后的峰面積計算不得大于對照溶液主峰面積的3.75 倍（0.75%）。

3.5 本研究的不足

本試驗中氧化降解還產生了4 個未知雜質，文獻報道[7]氧化降解未知雜質，可能是3，5-二氨基-6-（2，3-二氯苯基）-2-氧基-1，2，4-三嗪或3，5-二氨基-6-（2，3-二氯苯基）-4-氧基-1，2，4-三嗪。本方法分離檢測到的4 個未知氧化降解雜質有待進一步的LC-MS/MS 結構確證。拉莫三嗪雖然在60 ℃以內的條件下仍較穩定[7]，但在加強酸或強堿或30%雙氧水情況下并90 ℃水浴破壞試驗中，可產生少量的雜質E，考慮到該雜質有降解途徑，后續將對雜質E 進行質量標準制訂的研究。此外，基于企業生產檢驗實際考慮，本研究未對影響雜質B 和雜質C 相對保留時間和校正因子的流動相比例、柱溫、流動相pH 值進行更廣泛、更深入的耐用性與驗證研究。

3.6 小結

綜上所述，本方法專屬性強，能有效分離和檢測樣品中可能的工藝雜質和降解雜質，采用相對保留時間和校正因子來定量相關雜質，可應用于拉莫三嗪片和拉莫三嗪原料藥中有關物質的質量控制。