HPLC-FLD法測定不同產地林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量

劉芳馨，王月潔，許佳明，李季澤，趙寰宇，徐陽，鮑慧瑋*（.長春中醫藥大學藥學院，長春307；.白城醫學高等專科學校藥學系，吉林 白城 37000）

中國林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）是一種廣泛分布于中國東北的兩棲動物[1]，是我國傳統名貴補品，最早記載于《飲片新參》[2-3]，性涼、味咸、入肺腎經，具有養肺滋腎的功效。中國林蛙中雌蛙輸卵管干燥后取其脂肪狀物即為林蛙油，去油后殘留大量副產物，如林蛙卵等。林蛙卵和林蛙油中含有豐富的蛋白質、維生素、脂肪酸等營養成分[4-6]，具有降血脂、抑制血小板聚集、抗自由基等作用，林蛙油被稱為“軟白金”“林中之寶”“動物人參”“北方燕窩”[7-9]。

雌二醇（estradiol，E2，結構見圖1）是林蛙卵和林蛙油中最具代表性的甾體類激素[10]，它可以緩解因為年齡增長、機體功能下降而導致的雌激素分泌不足[11-12]，此外，雌激素還能影響機體的代謝、促進子宮的蛋白質合成等[13]。由于雌二醇具有熒光吸收特性，因此本文建立HPLC-FLD法測定不同產地林蛙卵和油中雌二醇的含量，為林蛙卵和林蛙油的安全食用、產品研發提供參考。

圖1 雌二醇化學結構式Fig 1 Chemical structure of estradiol

1 材料

1.1 試藥

東北地區林蛙油和林蛙卵，從各中藥材市場購買，由長春中醫藥大學中藥鑒定教研室肖井雷副教授鑒定為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensisDavid 雌蛙的干燥輸卵管和卵，來源見表1。雌二醇對照品（批號：100182-201205，含量以98%計，中國食品藥品檢定研究院）。

甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；磷酸（分析純，北京化工廠）；純凈水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

1.2 儀器

Agilent LC1100 高效液相色譜儀，配備FLD檢測器（美國安捷倫公司）；鼎力DFY-500（搖擺式）多功能高速中藥粉碎機（溫州頂力醫療器械有限公司）；DHG-9123A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（55∶45，V/V）；流速1.0 mL·min－1；柱溫為40℃；熒光檢測器激發波長為282 nm，發射波長為315 nm；進樣量為20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取雌二醇對照品5.42 mg，加甲醇超聲溶解并稀釋至250 mL 量瓶，搖勻，備用；精密吸取1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，制得2.168 μg·mL－1雌二醇的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取干燥的林蛙油和林蛙卵樣品，粉碎，過100 目篩，稱取粉末約2 g，加入20 mL 甲醇超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，過濾，重復操作2 次，合并濾液后60 ℃旋轉濃縮至5 mL，制得林蛙油和林蛙卵供試品溶液。

2.4 系統適應性試驗

將雌二醇對照品溶液、林蛙油和林蛙卵供試品溶液按照“2.1”項下色譜條件進行分析，得到色譜圖見圖2。其中，在與對照品溶液色譜圖相應的位置上，供試品溶液有相同保留時間的色譜峰，而且待測成分色譜峰與相鄰色譜峰均分離完全，理論塔板數以雌二醇計算均大于3000。

圖2 林蛙油和林蛙卵的HPLC-FLD 色譜圖Fig 2 HPLC-FLD chromatogram of oil and eggs of Rana Dybowskii

2.5 方法學試驗

2.5.1 線性關系考察 分別精密移取“2.2”項下雌二醇對照品溶液0.1、0.5、1、2.5、5、10 mL，加甲醇至10 mL，制得6 個不同質量濃度的雌二醇對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析。以雌二醇濃度為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到回歸方程為Y＝523.6X－61.66（r＝0.9999），表明雌二醇質量濃度在0.22 ～21.68 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗 將雌二醇對照品溶液按“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄色譜峰面積。計算雌二醇色譜峰面積的RSD值為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 將林蛙卵供試品溶液室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12 h 時按照“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇色譜峰面積的RSD值為1.5%，表明林蛙卵供試品溶液在12 h 內具有良好的穩定性。

2.5.4 重復性試驗 取批號為JY20180901 的林蛙卵樣品，按照“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇的平均含量為7.058 μg·g－1，RSD值為1.7%，表明該方法具有良好的重復性。

2.5.5 加樣回收試驗 取批號為JY20180901 的林蛙卵樣品6 份，粉碎，每份約1 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入質量濃度為7.12 μg·mL－1的雌二醇對照品溶液1 mL，再按照“2.3”項下方法制備，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。計算雌二醇的平均加樣回收率為100.4%，RSD值為1.4%，表明該方法具有良好的準確度。

2.6 樣品含量測定

稱取9 個批次的林蛙卵和林蛙油樣品各約2 g，分別制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，結果見表1。

表1 林蛙中雌二醇含量(μg·g－1，n ＝3)Tab 1 Estradiol content in Rana Dybowskii (μg·g－1，n ＝3)

3 討論

林蛙卵和林蛙油中主要含有的激素類成分為乙酸雄甾酮、前列腺素、美屈孕酮、雌二醇等，其中雌二醇含量較高[10]，且具有良好的藥效作用。本文建立HPLC-FLD 法測定林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量，并對不同產地9 批林蛙卵和林蛙油樣品進行測定，發現不同批次樣品中雌二醇含量差異比較大，且總體雌二醇含量較低。雖然動物藥的差異性較大，但是建立的含量測定方法仍可快速、穩定地檢測出雌二醇的含量，可作為監控林蛙卵和林蛙油中雌激素水平及評價林蛙卵和林蛙油質量的依據。

本試驗曾考察了色譜柱型號（Extend C18色譜柱、Alltima C18色譜柱、Agilent TC C18色譜柱），流動相體系（甲醇-水、乙腈-水），色譜柱溫度（30、35、40、45℃）和流速（1.0、1.5、2.0 mL·min－1）對雌二醇色譜峰分離度、峰形、出峰時間的影響[14-16]，結果采用本研究色譜條件時得到的色譜峰峰形最佳，與相鄰色譜峰分離最完全，且出峰時間適中，適合作為林蛙卵和林蛙油中雌二醇檢測的色譜條件。

在檢測器和檢測波長選擇時，對比了熒光檢測器和紫外檢測器，紫外檢測器較為常用，但是對于一些具有熒光的物質，熒光檢測器的靈敏度更高，更適用于一些較低含量的熒光物質，故本試驗選擇熒光檢測器測定林蛙油和林蛙卵中含量較低的雌二醇。采用HPLC-FLD 法測定雌二醇，并對激發波長和發射波長進行篩選，最終發現熒光檢測器激發波長為282 nm，發射波長為315 nm，測定效果較好，雌二醇色譜峰有較高吸收，與附近色譜峰分離較好。

在供試品提取方法選擇時，分別考察超聲提取法、回流提取法、浸漬提取法，其中超聲提取法和回流提取法提取效果最佳，而超聲提取法在提取效率方面更具優勢。隨后考察不同提取溶劑，例如甲醇、95%乙醇、無水乙醇等，最終發現甲醇提取效果最佳，干擾較少。