臨時用重組人干擾素α-2b鼻腔噴霧劑的配制和穩定性考察

阮麗梅，倪曉燕，呂鳳文，陸靜金，戴根苗，程鋼*（.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，合肥 300；.安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，合肥 30088）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），簡稱“新冠肺炎”[1]，傳播迅速，潛伏時間長，主要傳播途徑為呼吸道飛沫傳播及密切接觸傳播[2-3]。為了減少新型冠狀病毒（SARSCoV-2）的傳播，應加強直接接觸患者一線醫務人員的防護，在采用物理防控措施的基礎上，使用其他防護措施也是必要的。根據國家衛生健康委《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第7 版）推薦，目前用于COVID-19 的抗病毒治療主要有α-干擾素（α-IFN）、洛匹那韋、利托那韋（LPVr）及利巴韋林等[4]。其中重組人干擾素α-2b（rhIFNα-2b，以下簡稱IFNα-2b）具有廣譜抗病毒、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用。有研究表明α-干擾素的抗病毒機制可以預防病毒感染，持續用藥，可能會起到類似疫苗的作用，而使用干擾素噴霧劑可阻斷呼吸道病毒的快速傳播，起到預防作用[5-6]。國外研究報告了SARS-CoV-2 對重組人干擾素α和β（IFNα/β）的敏感性，證明了IFNα/β在抑制SARS-CoV-2 感染方面的潛在功效[7]，并推薦使用低劑量的IFNα-2b 在鼻腔噴霧（每日2次，每次0.5×106IU），配合羥氯喹口服（每日50 ～100 mg），用于臨床一線醫務人員，以預防COVID-19[8]。目前國內已上市的IFNα-2b 噴霧劑沒有鼻腔噴霧劑型，一般為皮膚科外用噴霧劑，適用于由病毒引起的初發或復發性皮膚單純皰疹，并不能直接噴于鼻咽部[9-10]。基于此，我們考慮配制IFNα-2b 鼻腔噴霧劑為醫護人員提供藥物預防，本研究以α-干擾素霧化方案為基礎，參考國內外多項鼻腔噴霧劑的相關文獻[8，11-13]，確定了制劑的處方和用法，利用臨床常用的IFNα-2b 注射液和0.9%氯化鈉注射液配制臨時用噴霧溶液，灌封于鼻腔用噴霧裝置中，并考察噴霧劑的穩定性，旨在為臨床一線醫護人員預防COVID-19 提供安全保障。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

IFNα-2b 注射液[安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，規格：每支3.0×106IU，批號：20191230、20200206-1、20200206-2]，0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，規格：100 mL，批號：19110722），人羊膜成纖維細胞（WISH）、水皰性口炎病毒（VSV）株[安徽安科生物工程（集團）股份有限公司]，硫乙醇酸鹽流體培養基（FTM，批號：20191021，青島高科技工業園海博生物技術有限公司），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號：20191030，青島高科技工業園海博生物技術有限公司）。

1.2 儀器

生物安全柜（SW-CJ-1F 型，蘇州凈化設備有限公司），隔水式培養箱（GHP9080，上海一恒科學儀器有限公司），恒溫培養箱（FYL-YS-50LK，北京福意聯電器有限公司），CO2培養箱（HERAcell vios 160i，Thermo Scientific），倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器有限公司），pH計（FE20，MettlerToledo），光吸收讀板機（SpectraMax 190，Molecular Devices），多劑量鼻腔噴霧泵[規格：每噴100 μL，萬通（蘇州）定量閥系統有限公司]，無菌噴霧劑玻璃瓶[規格：10 mL，萬通（蘇州）定量閥系統有限公司]。

2 方法

2.1 鼻腔噴霧劑的制備

無菌條件下操作，取IFNα-2b 注射液（3.0×106IU∶1 mL）3 支，以一次性無菌注射器吸取并注入無菌噴霧劑玻璃瓶中，再加入0.9%氯化鈉注射液6 mL，裝入鼻腔噴霧泵，擰緊密封，并蓋上防污罩，在瓶身貼上標簽，共制作3 批，批號標注為A、B、C，分別對應IFNα-2b 注射液批號20191230、20200206-1、20200206-2。

2.2 穩定性考察

2.2.1 儲存溫度試驗 將批號為A、B、C 的3 批樣品分別于（5±3）℃（以下簡稱5℃）、（25±2）℃（以下簡稱25℃）、（37±2）℃（以下簡稱37℃），相對濕度（60±10）%條件下避光貯存，分別于0 d、7 d、14 d、1個月、2個月、3個月，按考察項目取樣檢測。

2.2.2 振搖試驗 將3 批樣品于5℃條件下避光貯存，置于搖床上振搖，振動幅度為±10°，振動頻率為80 r·min－1。分別于0、7、14 d 按考察項目取樣檢測。

2.2.3 凍融試驗 將3 批樣品于（－20±5）℃放置48 h 完全冷凍，再置于5℃放置48 h 完全解凍，為一個凍融循環，分別于2 次、4 次凍融后按考察項目取樣檢測。

2.2.4 模擬使用試驗 將3 批樣品各取適量，模擬正常使用，每日4次，每次3噴，連續使用5 d，使用完畢后放置于5 ℃保存。分別于開始使用后的第1日、5日、1 個月、2 個月各取11 支樣品，按考察項目取樣檢測。

2.3 考察項目

依據《中國藥典》2015年版三部分別進行外觀、pH 值、無菌、生物學活性檢測。

2.3.1 外觀性狀 手持樣品容器頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉和翻轉容器，以明視距離（通常為 25 cm）分別于黑色和白色背景下用目檢視。質量標準：應為澄明液體，無肉眼可見異物。

2.3.2 pH 值 根據《中國藥典》2015年版第四部通則 0631 進行檢測。質量標準：pH 應為6.5 ～7.5。

2.3.3 無菌 根據《中國藥典》2015年版第四部1101 無菌檢查法，采用薄膜過濾法處理樣品。質量標準：應無菌生長。

2.3.4 生物學活性 根據《中國藥典》2015年版第三部第一法細胞病變抑制法（CPE），以中國食品藥品檢定研究院頒發的干擾素標準品校正。根據干擾素可以保護人羊膜細胞免受水泡性口炎病毒破壞的作用，用結晶紫對存活的WISH 細胞染色，于波長570 nm 處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH 細胞的保護效應曲線，以此測定干擾素生物學活性。質量標準：應為標示量的80%～150%，標示量為每瓶900 萬IU/9 mL。

3 結果

3.1 不同儲存溫度考察結果

A、B、C 3 批樣品0 個月的生物學活性分別為標示量的111%、111%和108%，于5℃、25℃存放3 個月、于37 ℃存放1 個月，3 批樣品生物學活性（%）在108%～137%，其他各項指標檢測結果也均符合質量標準要求，表明本品在5℃、25℃條件下可存放3 個月、于37℃條件下可存放1 個月，見表1。

表1 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑在不同溫度下儲存不同時間的穩定性Tab 1 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at different temperatures and time

3.2 振搖試驗考察結果

3 批樣品振搖試驗14 d，期間檢測各項指標，生物學活性（%）在102%～126%，其他各項檢測結果均符合質量標準要求，表明振搖條件下本品至少能保存2 周，見表2。

表2 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑在振搖條件下的穩定性Tab 2 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray under vibration conditions

3.3 凍融試驗考察結果

3 批樣品在第2、4 次凍融循環后檢測各項指標，生物學活性（%）在100%～137%，其他各項檢測結果均符合質量標準要求，表明凍融4 次后本品穩定性良好，見表3。

表3 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑凍融4 次的穩定性Tab 3 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray freeze-thaw 4 times

3.4 藥品模擬使用后5℃儲存穩定性

3 批樣品模擬使用5 d 后、5 ℃存放2 個月，結果生物學活性在99%～115%，其他各項檢測結果均符合質量標準要求，表明模擬使用后本品仍能保存2 個月，見表4。

表4 3 批IFNα-2b 鼻腔噴霧劑模擬使用后5 ℃儲存的穩定性Tab 4 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at 5 ℃after the simulated test

4 討論

4.1 研究目的和意義

在疫情期間，國家衛生健康委發布了系列方案、指南、通知等，根據醫務人員接觸COVID-19患者可能性及其暴露風險，提出分級防護措施[14]。但防護重點側重于物理隔離，比如戴口罩，穿隔離衣，戴護目鏡等，藥物預防則主要集中于中藥湯劑[15]，西藥預防未特別強調。α-2 型干擾素作為廣譜抗病毒藥，是《新型冠狀病毒肺炎診療方案》1 ～7 版推薦的主要治療藥物之一，推薦用法是大劑量霧化吸入（5.0×106IU/次，每日2 次），吸入的藥物顆粒沉積于氣道和肺部發揮療效。關于α-2型干擾素作為鼻腔預防用藥，在鼻腔發揮療效，則鮮有推薦報道，究其原因，是因為美國20 世紀80年代臨床試驗證實α-2 型干擾素對鼻黏膜有刺激作用（干黏膜、結痂、血涕等）[16-18]，從而限制了噴霧劑作為呼吸道病毒感染預防用藥的使用，至今美國FDA 未批準該劑型上市，中國亦然。而近期較多的研究表明，小劑量應用IFNα-2b 鼻腔噴霧，可有效防治各類病毒性上呼吸道疾病，包括預防COVID-19[8，19]，且不良反應并不明顯。醫院藥學人員因地制宜，于靜配中心生物安全柜內無菌操作，用IFNα-2b 注射液和0.9%氯化鈉注射液配制臨時用鼻腔噴霧劑，在保證關鍵質量的前提下，可迅速供給一線醫務人員使用。

4.2 噴霧劑處方與用法的思考

國內對IFNα-2b 鼻腔噴霧劑的劑量和安全性相關研究集中于2003年SARS 疫情之后，在參考國外報道的基礎上，陳清團隊[11-13]進行了大樣本（＞4000 人）的隨機對照試驗，成人日劑量1.8×106IU，每日用藥2 次，每次兩側鼻腔、咽喉各一噴，連續使用5 d，結果不良反應輕微，且均為可逆性反應，未出現血涕和嚴重不良反應報告，這可能與使用劑量低、用藥時間短有關[12]。本次COVID-19 疫情發生之后，有國外研究再次推薦使用低劑量IFNα-2b 鼻腔噴霧預防COVID-19[8]，日劑量1.0×106IU，每日鼻內噴霧2 次，既可減輕由SARS-CoV-2 引起的感冒癥狀，又可最大程度地降低IFNα-2b 的不良反應。

本試驗在參照國內外研究的基礎上，將噴霧劑的處方定為：IFNα-2b 注射劑3 支（3.0×106IU/支）與0.9%氯化鈉注射液6 mL 混合配制而成，相當于噴霧劑中IFNα-2b 的含量為1.0×106IU·mL－l；用0.9%氯化鈉作溶劑是為了維持滲透壓，保持等滲狀態[20]。推薦用法為：每日2 ～3 次，每次兩側鼻腔各1 噴、咽喉2 噴，以每噴量100 μL 計，相當于日劑量0.8×106～1.2×106IU，與文獻預防推薦量（日劑量1.0×106IU）接近[8]；使用時間為5 d，達到預防效果的同時避免嚴重不良反應。適用人群為臨床一線健康和有輕度呼吸道病毒感染癥狀的醫務人員。從本院醫務人員的使用情況反饋來看，用藥耐受性良好，未發生嚴重不良反應，用藥人員均未發生呼吸道病毒感染（包括COVID-19）。

4.3 穩定性考察結果分析

由于IFNα-2b 注射劑處方中含有人血白蛋白，為生物制劑，對各種環境條件的改變較敏感，本試驗考察了樣品在不同溫度下儲存的穩定性，在5℃條件下穩定性良好，至少可保存3 個月；在25℃和37℃條件下也可以保存一段時間，提示在臨床使用中即使忘記放入冰箱冷藏，短時間內也依舊安全有效；通過凍融試驗和振搖試驗表明樣品在極端環境下儲存和顛簸的運輸過程中依然可以保持良好的穩定性；模擬使用5 d 后的穩定性考察表明，用藥結束后于5℃放置2 個月，各項檢測指標均未發生較大變化，說明噴霧裝置的密閉性良好，能充分防止微生物和細菌的進入，在必要時可繼續使用。

4.4 制劑的優點與展望

鼻噴霧劑的處方通常包括原藥、防腐劑、穩定劑、抗氧化劑及緩沖劑等輔料，但是有的藥用輔料有一定的毒性，可能會對制劑安全性產生影響[21-22]，而本試驗配制的鼻噴霧劑直接用0.9%氯化鈉注射液稀釋而成，未添加其他輔料，可以避免輔料的毒副作用；國內上市的2 種IFNα噴霧劑商品名為捷撫（IFNα-2b，10 mL∶1.0×106IU，120 噴/瓶）和運德素（IFNα-1b，5 mL∶0.25×106IU），規格劑量小，即使可以臨時替代使用，但要達到1.0×106IU 的日劑量，需要噴120 噴（用完整瓶）或以上，臨床不易接受。而本次試驗配制的規格（9 mL∶9.0×106IU）每日只需噴8 ～12 噴，一瓶能保證5 ～7 d用量，使用方便。試驗采用的無菌噴霧裝置易于在市場上購得，利用醫院靜脈配置中心的無菌條件即可完成配制，不需要其他特殊設備，操作簡單，現配現用，特別適合新冠疫情等臨時性突發公共事件下對藥物特殊劑型的需求。

有研究表明，在治療COVID-19 時，干擾素霧化吸入可以產生氣溶膠污染空氣，增加醫護人員和患者交叉感染的風險[23-24]，而本試驗配制的噴霧劑與霧化吸入相比，不受使用環境及霧化設備的限制，患者依從性好，不易產生氣溶膠污染環境。但其能否在輕癥COVID-19 患者的治療中代替霧化吸入治療，從而減少交叉感染，需要繼續深入研究。當然，IFNα-2b 鼻噴霧劑在預防中還缺乏相關的臨床研究，其有效性和安全性還需要進一步驗證。