馬里苷通過調控自噬保護糖尿病db/db小鼠心肌損傷

祖力皮亞·阿布拉，李甜，蘭怡，克迪熱亞·卡迪爾，宋志鵬，張博翔，張雁潮，彭小雨，毛新民，5*（.新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊 80000；.新疆醫科大學基礎學院，烏魯木齊 80000；.新疆醫科大學附屬中醫醫院，烏魯木齊 80000；.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 80000；5.新疆維吾爾自治區中西醫重點學科，烏魯木齊 80000）

糖尿病是以細胞因子介導炎癥反應誘導胰島β細胞功能障礙，引起胰島素抵抗或進行性分泌不足的以血糖、血脂、蛋白質代謝紊亂為特征的代謝性疾病[1]。其中2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在糖尿病類型中最為常見，主要表現特征有高血糖、胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗和高胰島素血癥等。心血管病變的加速發展是2 型糖尿病主要致死致殘的主要原因之一[2]。尋找新的靶點或藥物對糖尿病患者的心肌病變進行預防和治療具有重要臨床意義。

目前，糖尿病心肌病變的機制不清。自噬是真核生物細胞內普遍存在的一種自穩機制，它通過溶酶體降解來消除細胞中多余和受損的結構，以維持細胞正常生理功能，從而適應各種不良刺激[3]。自噬在維持心臟功能和形態中起著重要作用。心肌細胞自噬不僅是心肌細胞正常的生理反應，同時還參與心臟功能紊亂、心肌纖維化、心肌肥大等心肌損傷過程，調控心肌細胞自噬對心肌功能紊亂發揮積極作用[4]。

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoriaNutt）又名昆侖雪菊，為菊科金雞菊屬的野生草本植物，始載于《新華本草綱要》[5]，其頭狀花序入藥，具有降血糖、降血脂、降壓、軟化血管、抑制細菌生長的功效，是防治糖尿病、冠心病等疾病的特殊藥食兩用的草藥[6]。研究發現，兩色金雞菊富含黃酮類化合物[7]。馬里苷（marein）是黃酮類化合物的主要活性成分之一，為查爾酮主要的葡萄糖苷[8]，其具有良好的降血糖[9]、調血脂、降血壓[10]等功效。本課題組前期研究已證實，兩色金雞菊的活性成分通過降血糖、抗氧化應激等發揮保護腎臟、肝臟的作用，但對心臟保護作用的機制仍有待于研究。因此，本實驗研究兩色金雞菊中馬里苷對2 型糖尿病db/db 小鼠心肌細胞損傷的保護作用及作用機制。

1 材料

1.1 動物

5 ～6 周齡，SPF 級雄性db/db 小鼠24 只，雄性db/m 小鼠6 只，體質量22 ～35 g [江蘇卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0010]。本實驗所用db/db和db/m 小鼠及實驗飼養條件均符合國家科學技術委員會制訂的《實驗動物管理條例》。

1.2 試藥

馬里苷由本課題組提取（新疆醫科大學藥學院從兩色金菊中提取，HPLC 法測定純度為99%），鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：H20023370），小鼠胰島素（INS）ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物科技有限公司，批號：MB-3315B 48T），蘇木素（Biosharp life Science，批號：69090030），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Thermo，批號：RH237562），聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（北京索萊寶有限公司，批號：20190708），抗LC3Ⅱ/Ⅰ單克隆抗體（批號：4108S）、抗P62 單克隆抗體（批號：39749S）（美國 Cell-Technology 公司），GAPDH（批號：GA003-R）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H ＋L）二抗（批號：IH-0011）（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

1.3 儀器

卓越精采血糖儀（瑞士Roche 公司），STS-2型脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司），Axio-ObserverZ1 倒置顯微鏡（德國ZEISS），Benchmark PLUS 全波長酶標儀、156-8001 型垂直電泳槽、Gel-DocXR ＋凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

db/db 小鼠24 只，按體質量和空腹血糖值（FBG）隨機分為模型組、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍 280 mg·kg－1）和實驗組（馬里苷，50 mg·kg－1）[11-12]，每組6 只；選取同來源的db/m小鼠6 只設為正常對照組。各組灌胃給藥，每日1 次，連續8 周，模型組和正常對照組給予相應的等體積的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。

2.2 小鼠體質量和FBG 檢測

觀察各組小鼠的精神狀態、活動情況，記錄大鼠攝食、飲水情況，注意小鼠皮毛色澤的變化等；給藥后每周檢測小鼠體質量；在給藥干預的第0、4、6、8 周，小鼠禁食不禁水，尾靜脈采血，用血糖儀檢測各組小鼠FBG。

2.3 生化檢測TC 和TG 含量

各組小鼠用藥物干預8 周后，禁食12 h 不禁水，眼眶取血，37℃放置30 min，3000 r·min－1離心10 min，分離血清。采用生化儀檢測血清中TC、TG 含量。

2.4 ELISA 檢測血清胰島素含量

采用ELISA 法按試劑盒說明測定血清胰島素水平。

2.5 HE 染色觀察小鼠心肌組織病理形態改變

小鼠頸脈脫臼處死，迅速提取小鼠心臟，用遇冷的生理鹽水沖洗干凈，吸水紙吸干多余的水分，即得心肌組織。取心肌組織，用4% 多聚甲醛溶液固定24 h 后，脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，脫水透明，封固，在光鏡下觀察小鼠心肌組織形態學改變。

2.6 透視電鏡觀察自噬小體

剪取約1 mm2小塊左心室組織置于2.5% 戊二醛固定，用 PBS 清洗，用四氧化鋨固定液固定2 h 后棄固定液，用乙醇逐級脫水，包埋切片，使用透視電鏡觀察心肌細胞自噬體。

2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測分析

將冷存的心肌組織解凍，取50 mg 組織研磨，加入預冷的含1% 蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液500μL，裂解30 min，勻漿，離心10 min（4℃ 12 000 r·min－1），取上清液，并用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度；通過電泳，轉膜，封閉，抗體孵育，顯色成像。以GAPDH 為內參，檢測微管關聯蛋白1A 和1B（LC3）、SQSTM1 蛋白（p62）的表達。

2.8 統計學分析

數據采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析處理，結果采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 馬里苷對db/db 小鼠FBG 和體質量的影響

正常對照組小鼠FBG 和體質量穩定。與正常對照組比較，模型組小鼠FBG 和體質量明顯升高；與模型組相比較，實驗組FBG 和體質量無明顯變化（見圖1）。

圖1 馬里苷對空腹血糖、體質量的影響Fig 1 Effect of marein on fasting glucose and body mass

3.2 馬里苷對小鼠TC、TG 及胰島素水平的影響

正常對照組小鼠TC、TG 及胰島素水平穩定。模型組小鼠較正常對照組小鼠血清中TC、TG 及胰島素水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組TC、TG 及胰島素水平顯著降低（P＜0.01），說明馬里苷可改善db/db 小鼠血脂異常和胰島素抵抗（見表1）。

表1 馬里苷對TC、TG 及胰島素水平的影響(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

表1 馬里苷對TC、TG 及胰島素水平的影響(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

注（Note）：與正常對照組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01；compared with the model group，**P ＜0.01）。

胰島素/（mU·L－1）正常對照組 1.82±0.521.43±0.1530.11±1.71模型組10.19±1.52##7.70±1.36##36.70±0.85##陽性對照組 7.62±1.25**5.86±0.59**25.93±3.99**實驗組 6.10±1.31**4.74±1.47**29.21±3.29**組別TC/（mmol·L－1）TG/（mmol·L－1）

3.3 小鼠心肌組織形態學變化

心肌組織HE 染色結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠心肌纖維肥大、腫脹明顯、可見部分心肌纖維斷裂及局部炎細胞浸潤、細胞間質明顯增多。陽性對照組和實驗組小鼠心肌纖維無明顯肥大、腫脹、心肌間質正常（見圖2）。

圖2 馬里苷對db/db 小鼠心肌組織病理學的影響（HE，400×）Fig 2 Effect of marein on the myocardial histopathology in db/db mice（HE，400×）

3.4 透射電鏡觀察心肌組織超微結構和自噬小體

透射電鏡檢測顯示，正常對照組小鼠顯示連續規則的肌節并構成肌原纖維，線粒體分布于肌原纖維之間，自噬小體形成；而模型組小鼠出現肌原纖維斷裂、肌原原纖維紊亂、線粒體排列紊亂，自噬小體數量減少；馬里苷干預后上述情況有所改善，且自噬小體數量有所增加（見圖3）。

圖3 馬里苷對心肌超微結構和自噬小體的影響Fig 3 Effect of marein on the myocardial ultrastructure and autophagosomes

3.5 馬里苷對心肌組織自噬指標p62 和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達的影響

自噬對心臟功能及結構的維持至關重要，在應激狀態下自噬的激活可以通過降解、循環代謝產物產生能量來維持心肌細胞存活。Western blot 結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠心肌組織p62 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表達水平顯著降低（P＜0.01），表明心肌細胞自噬被抑制；馬里苷干預后，小鼠心肌組織p62表達水平顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表達水平顯著升高（P＜0.05），表明馬里苷可以促進心肌細胞自噬（見圖4）。

圖4 馬里苷對db/db 小鼠心肌自噬的影響Fig 4 Effect of marein on the myocardial autophagy in db/db mice

4 討論

據流行病學調查統計，2019年全球糖尿病患病率為9.3%（4.63 億人），到2030年預測患病率將上升到10.2%（5.78 億），到2045年將上升到10.9%（7 億）[13]。在2 型糖尿病患者中，患有心血管疾病的數量逐日上升[14]。1972年臨床首次發現與2 型糖尿病有關的心肌病患者，并推測患者心肌病變由彌漫性心肌纖維化、心肌肥大和糖尿病性微血管引起的[15]。

馬里苷為兩色金雞菊黃酮類化合物主要有效成分之一。馬里苷具有抗氧化[16]和較好的自由基清除能力[17]，且可以改善高血糖引起的胰島素抵抗，抑制細胞凋亡[12]。本研究發現，馬里苷藥物干預后，糖尿病小鼠TC、TG 和胰島素水平顯著降低。課題組前期研究發現，兩色金雞菊黃酮有效成分，在高糖誘導的HUVEC 細胞損傷模型中，通過促進自噬，從而發揮對HUVEC 內皮細胞損傷的保護作用[18]。本實驗采用db/db 糖尿病動物模型，探討兩色金雞菊黃酮主要有效成分馬里苷通過調控自噬對糖尿病db/db 小鼠心肌細胞損傷的保護作用。

自噬是一種自我降解的過程，在平衡機體發育所需能量和調節營養等方面至關重要。自噬可以清除錯誤折疊或聚集的蛋白、受損的細胞器（包括線粒體、內質網、過氧化物酶體等）以及細胞內病原體，被認為是自我保護過程。自噬在癌癥、糖尿病、神經變性、心肌病、肝病、感染性疾病與自身免疫性疾病等疾病的預防和治療過程中發揮關鍵的作用[19]。Sybers 等[20]在1976年發現了心肌細胞內存在自噬現象，心肌細胞自噬失調導致心肌功能紊亂、心肌纖維化、心肌肥大、心力衰竭和過早死亡等[4]。自噬是維持心肌細胞大小以及整體心臟結構和功能的一種穩態機制，在衰竭心臟中通過上調自噬從而使心肌細胞免受血流動力學應激的影響[21]。自噬障礙可以引起心肌肥大、壓力超負荷心力衰竭、缺血性心肌病及糖尿病心肌病等[22]。自噬的調控機制很復雜，它是由多種信號通路及其調控因子共同介導完成的。微管關聯蛋白1A 和1B（microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3，LC3）是一種可溶性蛋白，分布在哺乳動物組織中，是哺乳動物Atg8基因的同源物，主要定位在前自噬泡和自噬泡膜的表面，是自噬體特異性標志蛋白[23]。LC3 前體加工形成LC3-Ⅰ，經泛素化修飾后通過Atg7/Atg3 與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）結合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ轉變到LC3-Ⅱ是自噬啟動的標志，由LC3-Ⅱ/Ⅰ反映自噬表達水平[24-25]。p62 是一種多域蛋白，也是哺乳動物選擇性自噬的載體蛋白[26]，p62 可與定位在自噬小體內膜上的LC3-Ⅱ形成復合體，從而削弱LC3-Ⅱ的活性，同時，p62 蛋白本身又受自噬調節的作用，其表達與自噬活性成負相關[27]。研究發現，高糖缺氧誘導的人臍靜脈內皮細胞中，自噬相關蛋白LC3 表達下調，p62 表達上調，高糖缺氧條件下，自噬功能受損，上調自噬可以降低凋亡率，保護細胞受損[28]。本實驗研究發現，模型組中，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達顯著降低，p62 的表達顯著升高，自噬小體數量減少，自噬被抑制，心肌肌原纖維斷裂，心肌纖維肥大、腫脹、排列紊亂，心肌結構發生病理性改變；馬里苷干預后，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達顯著升高，p62 的表達顯著降低，自噬小體數量增加。提示馬里苷可促進自噬，改善心肌組織結構，保護心肌細胞損傷。

綜上所述，本實驗首次探討馬里苷對糖尿病db/db 小鼠心肌細胞的保護作用，并初步證實馬里苷通過促進自噬，改善心肌組織結構，保護心肌細胞損傷，但其具體機制有待進一步研究。