知母配方顆粒中4種成分在大鼠體內的藥動學研究

朱琳，毛夢倩，劉亮亮，劉玨玲（山西衛生健康職業學院，山西 晉中 030619）

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，始載于《神農本草經》，是常用中藥復方的組成部分[1]。現代藥理研究表明，知母提取物具有抗腫瘤、抑制血小板聚集、改善阿爾茨海默病癥狀、降脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖作用[2-8]。知母中的活性成分主要有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、木脂素類、黃酮類、多糖類等[9-13]，其中皂苷類成分像知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ被證實是治療阿爾茨海默病、抗凝血、抗血栓以及抗癌的重要活性物質[4，6]。知母配方顆粒是本實驗室課題組將知母飲片經水提醇沉、減壓濃縮、凍干、制粒等工藝優化后制備而成的。然而，中藥制劑的生產過程受多環節、多因素的影響，容易造成標準化程度不高、體內過程有差異等問題，進而導致臨床藥效的差異[14-15]。等效性研究是評價新劑型質量的重要方式，即通過測定血藥濃度的方法來比較不同的制劑對藥物吸收的影響，以及藥物不同制劑之間的差異，以此來推測其臨床治療效果差異的可接受性。

本研究采用HPLC-MS/MS 法同時測定大鼠血漿中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 種成分的血藥濃度，并比較健康大鼠給予配方顆粒與飲片提取物后4 種成分的藥動學行為差異，初步評價知母配方顆粒的生物等效性特征，為其臨床合理用藥及后續研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Exion LC AC 液相系統串聯4000 Tripe Quad質譜儀（美國AB Sciex 公司）；XPE 105 十萬分之一電子天平（瑞士梅特斯-托利多公司）；Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）；AutoVap S60 型多樣品濃縮氮吹儀（美國ATR 公司）；Analyst V1.5.2 工作站（美國AB Sciex 公司）。

1.2 試藥

新芒果苷（批號：20190319）、芒果苷（批號：20181013）、知母皂苷BⅡ（批號：20190219）、知母皂苷AⅢ（批號：20190423）（純度≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；磺胺甲噁唑（批號：100025-201505，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國Fisher Scientific 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。知母購于國大藥房晉中分店，經山西衛生健康職業學院生藥教研室楊翠玲副教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖。

1.3 動物

雄性SD 大鼠12 只，體質量（200±20）g[山西衛生健康職業學院動物實驗中心，許可證號：SCXK（晉）2019-0001]。飼養于普通環境中，室溫20 ～30℃，相對濕度30%～70%，室內光照明暗交替12 h，普通飼料投喂，自由飲用凈化水。

2 方法

2.1 色譜條件與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（75 mm×2.1 mm，2.6 μm）， 流動相為水（0.1%甲酸，A）-甲醇（0.1%甲酸，B），梯度洗 脫（0 ～1 min：90% ～68%A；1 ～5 min：68%～ 25%A；5 ～7 min：25%～10%A；7 ～8 min：10%A），流速0.4 mL·min－1，進樣量2μL，柱溫30℃。

2.1.2 質譜條件 電噴霧電離源（ESI 源），負離子方式掃描；離子噴霧電壓－4500 V，離子源溫度500 ℃；真空度（10 e－5）3.0 Torr；GS1、GS2與CUR 均為氮氣，壓力分別為40、40 和20 psi；掃描方式為多反應監測（MRM）；待測物離子通道及各參數數據見表1。

表1 待測物和內標的質譜條件Tab 1 Mass spectrometry condition of analyte and IS

2.2 系列混合對照品溶液的制備

分別取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，制成質量濃度為1.0、3.0、3.0、1.0 mg·mL－1的待測物儲備液。分別精密量取各儲備液適量，用甲醇稀釋成含新芒果苷（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 μg·mL－1），芒果苷（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 μg·mL－1），知母皂苷BⅡ（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 μg·mL－1）和知母皂苷AⅢ（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 μg·mL－1）的系列混合對照品溶液，4℃冰箱內保存，備用。

2.3 內標溶液的配制

取磺胺甲噁唑對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1.0 mg·mL－1的儲備液。再精密量取儲備液適量，加甲醇稀釋成質量濃度為10.0 μg·mL－1的內標對照品溶液，4℃冰箱保存，備用。

2.4 大鼠灌胃給藥溶液的制備

知母飲片：取知母飲片約60 g，稱定，加入10 倍量30%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，過濾，濾渣再加8 倍量30%乙醇，回流提取1 h，過濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至0.95 g·mL－1，備用。

知母配方顆粒：取實驗室自制配方顆粒適量，加水溶解，制成質量濃度為0.95 g·mL－1（知母飲片含量）的溶液，備用。

2.5 血漿樣品的采集

知母飲片組和配方顆粒組大鼠各6 只，給藥前禁食12 h，期間自由飲水。兩組分別灌胃給予知母飲片和配方顆粒灌胃液。于口服給藥前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、36 h 大鼠眼眶靜脈取血約0.5 mL，置于經肝素處理的離心試管中，搖勻后靜置30 min，低速（4000 r·min－1）離心5 min，取上層血漿，于－80 ℃冰箱中凍存待測。

2.6 血漿樣品的預處理

取大鼠空白血漿100 μL 置1.5 mL EP 管中，加甲醇10 μL，內標溶液10 μL，渦旋混合30 s 后，加乙腈100 μL，渦旋混合3 min，離心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液置另一1.5 mL EP 管中，氮氣流吹干，殘渣加初始比例流動相100 μL 復溶，渦旋1 min，離心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液，進樣分析。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性 分別取6 份不同來源的大鼠空白血漿100 μL，按“2.6”項下方法操作（不加內標溶液），進樣2 μL，得空白血漿樣品色譜圖（見圖1a）；取線性最低點的標準溶液和內標溶液加入空白血漿，按“2.6”項下方法操作，得模擬血漿樣品色譜圖（見圖1b）：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和IS 的保留時間分別為2.56、3.98、5.06、6.78 和3.67 min；取大鼠灌胃給予知母配方顆粒6.0 h 后的血漿樣品，按“2.6”項下方法操作，得給藥后血漿樣品色譜圖（見圖1c）。結果表明，內源性物質以及代謝物不干擾血漿中待測物和IS 的測定，方法專屬性良好。

圖1 空白血漿（a）、空白血漿加待測物和內標（b）、給藥6 h 后血漿加內標（c）的色譜圖Fig 1 Chromatogram of a blank plasma sample（a），blank plasma spiked with analytes and IS（b）and plasma sample 6 h after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules（c）

2.7.2 標準曲線與定量限 取大鼠空白血漿100μL，加入待測物標準系列溶液10 μL，制備模擬血漿生物樣品，除不加甲醇外，其余按“2.6”項下方法操作，每一濃度進行雙樣本分析，進樣2μL，記錄色譜圖。待測物與內標峰面積比值為標準曲線縱坐標y，待測物質量濃度（ng·mL－1）為橫坐標x，用加權（w＝1/x2）最小二乘法進行回歸運算，求得各組分標準曲線，結果見表2。

表2 新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的標準曲線參數和定量下限Tab 2 Linearity and LLOQ of neomangiferin，mangiferin，timosaponin BⅡ and timosaponin AⅢ

2.7.3 精密度和準確度 取大鼠空白血漿100μL，制備定量限、低、中、高4 個濃度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的濃度分別為1.0、2.5、12.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的濃度為10.0、25.0、125.0、800.0 ng·mL－1）的質控（QC）樣品，每一濃度平行6 份，連續3 個分析批進樣分析（不小于兩天），計算QC 樣品濃度。結果表明，4 種成分的日內和日間準確度的RE 分別小于10.3%和12.2%，日內和日間精密度的RSD分別小于11.4%和13.3%，符合相關要求。

2.7.4 提取回收率 取大鼠空白血漿上清液100μL，平行制備低、中、高3 個濃度的QC 樣品各6 份進行分析，獲得相應峰面積A；另取空白血漿100 μL，按“2.6”項下方法操作（不加內標溶液），向獲得的上清液中加入低、中、高濃度的混合對照品溶液和內標溶液各10 μL，渦旋混合3 min 后于氮氣流下吹干，以100 μL 初始流動相復溶。取2 μL 上清液進樣，獲得相應峰面積B。以峰面積比值（A/B）計算提取回收率。結果表明，各待測物提取回收率在80.2%～116.6%，RSD＜2.0%，符合相關要求。

2.7.5 基質效應 取不同來源的大鼠血漿樣品100 μL，除不加內標溶液外，按“2.6”項下方法操作，向獲得的樣品中加入低、中、高3 個濃度的混合對照品溶液10 μL 和內標溶液10 μL，渦旋混合3 min 后于氮氣流下吹干，以100 μL 初始流動相復溶，離心，取2 μL 上清液進樣，獲得相應峰面積；另取相應濃度的混合對照品溶液10μL 和內標溶液10 μL，渦旋混合3 min 后于氮氣流下吹干，以100 μL 初始流動相復溶，取2 μL上清液進樣，獲得相應峰面積，上述每一濃度平行6 份。計算基質效應，各待測物基質效應穩定，在78.9%～109.7%，RSD＜15%。

2.7.6 樣品穩定性 取大鼠空白血漿100 μL，制備低、高2 個濃度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的質量濃度分別為2.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的質量濃度為25.0、800.0 ng·mL－1）的QC 樣品，平行制備3 份，考察樣品在－80℃凍藏1 個月、3 次凍融循環、室溫放置24 h 以及自動進樣器放置（4℃）8 h 的穩定性。結果各待測物在上述條件下穩定性良好，RSD均＜10%。

2.8 樣品測定和數據處理

血漿樣品按“2.6”項下方法處理后分析測定。同時制備不少于當批樣品總數5%的QC 樣品（含低、中、高3 個濃度），將QC 樣品均勻穿插于待測樣品中于同一批進樣分析。由QC 樣品決定此分析批數據是否可用。采用非房室模型分別處理上述血藥濃度測定數據，求算藥動學參數（Phoenix WinNonlin 8.1）。其中達峰時間tmax和峰濃度Cmax為實測值；梯形法計算藥時曲線下面積AUC；以血藥濃度對時間作半對數曲線，以消除相最后4 點進行線性擬合，計算半衰期t1/2。

將得到的主要藥動學參數（AUC0～t、AUC0～∞、Cmax）經對數轉換后應用SPSS 20.0 進行獨立樣本t檢驗，其余參數（tmax、t1/2）應用SPSS 20.0 進行非參數檢驗，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 種成分的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學參數見表3。

表3 灌胃給藥后知母配方顆粒與飲片后各成分的藥動學參數(Mean±SD，n ＝6)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of 4 components in rat plasma after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces (Mean±SD，n ＝6)

圖2 知母配方顆粒和飲片中4 種成分在大鼠體內平均血藥濃度-時間曲線（n ＝6）Fig 2 Mean plasma concnetration-time curve of 4 active ingredient in the Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces in rats（n ＝6）

3 討論

3.1 HPLC-MS/MS 條件的優化

新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ在電噴霧離子源正負離子檢測模式下均有響應，但在正離子模式下響應較低，因此選擇負離子檢測。考察乙腈與甲醇作為有機相，結果用甲醇作為有機相時，各待測物的響應值較大，且背景噪音小，因此選擇甲醇作為有機相。當流動相中加入甲酸后，色譜行為明顯改善，隨著甲酸含量的增加，各待測物的響應逐漸降低，最終選擇0.10%甲酸濃度。

3.2 血漿樣品處理方法的考察

血漿樣品預處理中本研究考察了沉淀蛋白法和液液萃取法對各成分的影響，發現不同萃取劑下的提取效率都不是很好，而采用乙腈沉淀蛋白時較有效除去內源性雜質，且提取回收率較高，之后又考察了乙腈比例對提取率的影響，結果發現當空白血漿與乙腈比例為1∶1 時，回收率最高，因此選擇乙腈（1∶1）沉淀蛋白法進行血漿樣品預處理。

3.3 藥動學結果

方差分析結果表明，健康大鼠分別灌胃給予知母配方顆粒和飲片提取物后，4 種有效物質的藥動學參數均無顯著性差異；經雙單側檢驗法分析，知母配方顆粒和飲片各成分的AUC比值在0.80 ～1.25，即ln0.80 ≤lnAUCT/AUCR ≤ln1.25，該置信區間在[ln0.80 ～ln1.25]，認為在90%的置信度下，兩種劑型AUC具有生物等效性；知母配方顆粒和飲片各成分的Cmax比值在0.70 ～1.43，即Cmax比值為ln0.70 ≤lnCmaxT/CmaxR ≤ln1.43，該置信區間在[ln0.70 ～ln1.43]，可以認為在90%的置信度下，兩種劑型Cmax具有生物等效性，實驗表明新劑型和古方劑型之間生物等效，輔料和制備工藝對藥方中有效成分無明顯影響。

此外，芒果苷、知母皂苷BⅡ在兩組大鼠體內均呈現雙峰現象。雙峰現象在一定程度上可延長藥物在體內的作用時間，有一定的藥理學意義，但更明確的作用機制有待進一步深入研究。

本研究建立了同時測定大鼠血漿中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ4 種成分的HPLC-MS/MS 方法，并對健康大鼠分別灌胃給予知母配方顆粒和飲片后4 種化合物的藥動學行為進行了比較，結果表明，配方顆粒與飲片之間具有生物等效性，為知母配方顆粒的工業化生產及臨床合理用藥提供了一定的參考。