六味地黃提取物及其聯合順鉑對人肝癌BEL-7402細胞遷移和血管新生因子基因表達的影響

周牡娜，劉檢，石雕，劉蓉，鄒自征，歐陽方丹*（.益陽醫學高等專科學校，湖南 益陽 4000；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 40000；.湖南省直中醫醫院，湖南 株洲 4000）

由于惡性腫瘤性質類型各異、累及的組織和器官不同、病期不同以及現在診斷技術的局限，大多數惡性腫瘤患者在確診時已為中晚期，手術治療無法實現，因而治療藥物的研發十分必要[1]。目前中醫藥治療腫瘤的臨床研究正進入循證醫學、個體化、規范化的時代，因其有降低毒副作用、減輕癥狀或延長帶瘤生存期等特點得到了廣泛認可[2]。順鉑是臨床治療中常用的化療藥物，但順鉑產生的腎毒性、耳毒性、耐藥性等在臨床上不可避免，近年來以順鉑為核心聯合用藥的“增效減毒”研究較多[3]，而六味地黃具有改善腎功能、抗氧化、改善免疫功能、消除自由基、抗腫瘤等作用[4]。研究發現六味地黃丸能夠對放療具有增效減毒的作用[5]，同時通過減少誘發腫瘤炎癥因子的生成，調節免疫力，增強抗癌基因和抑制原癌基因表達等來發揮抗腫瘤作用[6]。本文通過觀察六味地黃提取物及其聯合順鉑對人肝癌BEL-7402 一般形態學和細胞遷移的影響，并探討其對血管新生因子基因表達水平的影響，闡述其抗腫瘤的可能機制，為臨床治療肝癌提供參考依據。

1 材料

1.1 六味地黃藥材

六味地黃由熟地黃（玄參科植物地黃干燥塊根，益陽三和中藥飲片有限公司）24 g，山萸肉（山茱萸科植物山茱萸果肉，三湘中藥飲片有限公司）12 g，山藥（薯蕷科植物薯蕷干燥根莖，永靛中藥飲片有限公司）12 g 及澤瀉（澤瀉科植物澤瀉的干燥塊莖，三湘中藥飲片有限公司）、牡丹皮（毛茛科植物牡丹干燥根皮，三湘中藥飲片有限公司）、茯苓（多孔菌科真菌茯苓干燥菌核，博世康中醫藥有限公司）各9 g 組成，經湖南省直中醫醫院藥學部主管藥師石雕鑒定以上中藥飲片均符合用藥標準。

1.2 儀器及試藥

CO2培養箱（美國Thermo 公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、1640 培養基（Gibco 公司）；血管內皮生長因子（VEGF）、血管素-2（Ang-2）、血小板反應素（TSP）、金屬蛋白酶-2 組織抑制因子（TIMP2）人抗體（武漢博士德公司）；順鉑（齊魯制藥有限公司，規格：10 mg，批號：8C0214B02）。

1.3 細胞株

人肝癌BEL-7402 細胞（Procell）。

2 方法

2.1 六味地黃提取物的制備

按“1.1”項下藥材量打粉過篩后稱取粉末25 g，用60%乙醇50 mL 浸潤6 h，超聲（25 Hz，60 ℃）提取40 min，過濾，濾渣用60%乙醇50 mL 提取40 min，過濾，合并濾液，揮干乙醇，定容至25 mL，制備成生藥含量為1 g·mL－1的提取物待用。作用于細胞前，先用培養基稀釋至500 mg·mL－1，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，滅菌，并用培養基稀釋至所需的藥物濃度。

2.2 初篩六味地黃提取物給藥濃度

調整BEL-7402 細胞密度至5000 個/孔接種于96 孔培養板，靜置培養24 h，設置六味地黃提取物質量濃度梯度（500、400、300、200、100、50、25、12.5 mg·mL－1，即C1 ～C8），另設對照組，合計9 組，每組3 個復孔。待細胞充分貼壁后，加入不同質量濃度六味地黃提取物，正常組則加入等體積的培養液。分別繼續培養48 h、72 h 后，每孔加入完全培養基180 μL、CCK8 溶液20 μL，孵育4 h 后用酶標儀于450 nm 波長下測定各孔吸光度值（A），并計算各組細胞的相對抑制率。

2.3 觀察BEL-7402 細胞的一般形態學

胰蛋白酶溶液消化BEL-7402 細胞后接種于6孔細胞培養板中，每組設置3 個復孔。培養至細胞完全貼壁后，順鉑（1 mg·mL－1）組、六味地黃提取物（100 mg·mL－1）組、聯合用藥（六味地黃提取物100 mg·mL－1＋順鉑1 mg·mL－1）組加入相應藥物，對照組加入等量培養液。分別處理48 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態及形態學。

2.4 細胞劃痕法檢測BEL-7402 細胞遷移能力

將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，調整至適宜密度，接種于6 孔細胞培養板，每組設置3 個復孔。培養至細胞完全貼壁后，棄掉孔內液體，換成無血清基礎培養基過夜，次日采用200 μL 規格的槍頭，同時用直尺比著均勻劃出“十”字，PBS 潤洗3 次，加入低血清（含5%FBS）培養基，除對照組給予等量培養液外，其余各組加入相應藥物，繼續培養48 h 后，對各孔“十”字的四個邊進行觀察，并拍照記錄細胞生長及遷移情況，隨機選取10 個視野進行計數，并計算細胞遷移率。

2.5 Western blot 法檢測VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2 蛋白表達

按“2.3”項下方法培養后收集細胞，加入RIPA 細胞裂解液和含1%PMSF 蛋白酶抑制劑混合液，于4℃條件下裂解2 h，12 000 r·min－1離心15 min，吸取上清液，分裝備用。采用BCA 法進行蛋白（TSP、TIMP2、VEGF、Ang-2）含量測定，依據蛋白分子質量大小選擇適宜的電泳濃縮膠和分離膠。待上樣緩沖液和蛋白樣品混勻、變性后，進行上樣、電泳、轉模、封閉后，加入一抗稀釋液（VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2），孵育過夜（4℃），加入二抗緩沖液（HRP 標記），室溫振搖孵育1 h，通過定量分析和蛋白印跡成像系統進行掃描，計算各蛋白目標蛋白條帶與內參蛋白條帶的光密度比值以表示目標蛋白的相對表達量。

2.6 RT-PCR 法檢測VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2基因水平

將細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，調整至適宜密度，接種于6 孔細胞培養板，每組設置3 個復孔。培養至細胞完全貼壁后，各干預組加入對應的藥物，對照組加入等量培養液。37℃、5%CO2培養箱培養48 h，吸棄培養基，PBS 潤洗2 次，采用Trizol 法（4℃，60 min）提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒轉錄合成cDNA，以real-time PCR 儀進行擴增，用2－△△Ct法檢測目標基因mRNA 的相對表達量。

2.7 統計學處理方法

實驗數據用±s表示，SPSS 20.0 軟件統計分析，組間比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05 代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 六味地黃提取物給藥濃度初篩結果

不同質量濃度六味地黃提取物對BEL-7402細胞均具有明顯的抑制作用，質量濃度為100 mg·mL－1作用48 h 后的平均細胞抑制率更接近50%，結果見圖1，故選擇質量濃度為100 mg·mL－1作用時間48 h 進行后續實驗。

圖1 不同濃度六味地黃提取物對BEL-7402 細胞的影響Fig 1 Effect of different concentrations of Liuwei Dihuang extracts on BEL-7402 cells

3.2 對BEL-7402 細胞一般形態學的影響

對照組細胞生長狀態良好，細胞分布均勻，胞質均勻透亮，胞核清晰。與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯合用藥組細胞干預48 h 后均可見貼壁細胞減少，部分細胞變圓變小，細胞間距增大，脫落浮于培養液中；聯合用藥組可見有較多待脫落細胞。結果見圖2。

3.3 對BEL-7402 細胞遷移能力的影響

與對照組比較，細胞劃痕面積愈合率順鉑組為（35.6±3.5）%、六味地黃提取物組為（42.6±2.8）%、聯合用藥組為（28.4±4.2）%，細胞遷移能力均下降，兩側細胞間距明顯加大，無細胞向劃痕處遷移生長，且死亡細胞顯著增加。結果見圖3。

圖3 各組對BEL-7402 細胞遷移的影響（100×）Fig 3 Effect of each group on the migration of BEL-7402 cells（100×）

3.4 對細胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 蛋白表達水平的影響

與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯合用藥組BEL-7402 細胞內TSP、TIMP2 蛋白表達水平顯著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表達水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯合用藥組細胞內TSP、TIMP2 蛋白表達水平顯著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表達水平顯著降低。結果見圖4。

圖4 各組細胞內VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 蛋白表達水平（± s，n ＝3）Fig 4 Protein expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

3.5 對細胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 基因表達水平的影響

與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯合用藥組細胞內TSP、TIMP2 mRNA 表達水平顯著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表達水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯合組細胞內TSP、TIMP2 mRNA 表達水平顯著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表達水平顯著降低，結果見圖5。

圖5 各組細胞內VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 基因表達情況（± s，n ＝3）Fig 5 Gene expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

4 討論

目前，每年全球新增肝癌患者30 萬～100萬例[7]，中國占全世界發病人數的50% 以上[8]。血管新生是指從已經存在的毛細血管網上再大量生成新生血管的過程，新生血管為無限增殖的細胞提供充足的養料和氧氣[9]。當腫瘤生長到1 ～2 mm 時，腫瘤內部就會有新生血管的生成，以維持腫瘤細胞對氧氣和營養物質的需要，新生血管已成為一個具有腫瘤治療前景的靶點[10]。新生血管功能和結構的不完整可促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和遠處轉移[11]。新生血管是腫瘤生長、轉移的基礎。腫瘤細胞的無限增殖和遷移是肝癌相關死亡的重要原因。細胞劃痕實驗結果顯示，與對照組比較，各用藥組BEL-7402 細胞間距明顯加大，無細胞向劃痕處遷移生長，且死亡細胞顯著增加，其中聯合用藥組的抑制細胞遷移作用更為明顯，提示六味地黃提取物及其聯合順鉑對BEL-7402 細胞遷移生長具有明顯的抑制作用。

腫瘤新生血管形成過程與促血管生成因子和抗血管生成因子正負調節失衡有關，血管系統被激活，導致血管生長過度或退化，新生血管是腫瘤發生和發展中一個重要的病理特征。VEGF 是一種同源二聚體糖蛋白，是調控血管生成的重要表達因子，VEGF 表達上調可促進血管內皮細胞有絲分裂、新生血管生成。此外，VEGF 還可以自分泌的形式促進腫瘤細胞生長[12]。腫瘤組織的缺氧、缺血、ras基因突變等生物因子的變化也會影響VEGF 的表達等[13]。Ang-2 主要呈點狀分布，僅局限在內皮細胞和相關的外周細胞中，通過抑制 Ang-1 活化程度，形成內分泌調節環路以維持血管生長、退化的動態平衡。Ang-2 的表達增加可促進腫瘤血管新生和新的毛細血管再建及形成[14]。有研究表明，Ang-2 在腫瘤組織中呈高表達[15]。本實驗結果顯示，與對照組比較，各干預組細胞內VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA 表達水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯合用藥組細胞內VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA表達水平顯著降低。這提示六味地黃提取物及其聯合順鉑可能通過抑制VEGF、Ang-2 mRNA 表達，繼而下調VEGF、Ang-2 蛋白表達水平來抑制血管新生。血小板反應蛋白（TSP）能夠抑制內皮細胞的增殖及遷移、抑制內皮細胞管狀結構形成，是一種有效的抗血管新生活性的分泌蛋白。研究發現，TSP 可通過影響抑制基質金屬蛋白酶的轉化成有活性的形式以及通過結合CD36和CD148受體，抑制肝癌細胞遷移和新生血管生成[16]。基質金屬蛋白酶（MMPs）是目前發現的唯一能分解纖維類膠原的酶，以無活性的酶原形式分泌，在細胞外基質重塑的部位易于誘導表達。TIMP 是MMPs 的內源性特異性抑制因子[17]。MMP2 是明膠酶，能特異性的降解基膜中的Ⅳ型膠原，促進腫瘤的轉移，TIMP2 是MMP2 的抑制劑，屬于非糖基化蛋白，它以共價鍵的形式與MMP2 相結合成1∶1 復合體，對血管新生具有重要的調節作用，被證實可抑制多種癌癥的惡性轉移過程[18]。本研究結果顯示，與對照組比較，各用藥組中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表達水平均顯著升高；與順鉑組和六味地黃提取物組比較，聯合用藥組中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表達水平均顯著升高。這提示六味地黃提取物及其聯合順鉑可能通過促進TSP、TIMP2 mRNA 表達，繼而上調TSP、TIMP2 蛋白表達水平發揮抑制抗血管新生的作用。

綜上，六味地黃提取物及其聯合順鉑對BEL-7402 細胞遷移生長具有明顯的抑制作用，并可能通過促進BEL-7402 細胞TSP、TIMP2 的mRNA表達水平，抑制VEGF、Ang-2 的mRNA 表達水平來抑制肝癌細胞血管新生。本研究從基因表達水平研究六味地黃提取物抗腫瘤的機制，為其臨床抗腫瘤提供了參考依據，后續將進一步通過體內動物實驗探究六味地黃提取物聯合順鉑抗腫瘤的作用機制。