人參皂苷Rh3聯(lián)合多西他賽抑制PC3腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

孟佳佳，王丹丹，王陳萍（南通市第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)部，江蘇 南通 226003）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常見(jiàn)的男性泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，在西方國(guó)家中PCa 位居男性新發(fā)惡性腫瘤的第1 位，病死率在惡性腫瘤中居第3 位[1]。我國(guó)PCa 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，已成為我國(guó)男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[2]。目前對(duì)PCa 缺乏安全有效的治療措施。

多西他賽（docetaxel）屬于第二代紫杉醇類化療藥物，能減輕PCa 患者的癥狀，提高生存率和生活質(zhì)量，但其產(chǎn)生的不良反應(yīng)和耐藥性不可忽視[3]。然而，在治療PCa 中，多西他賽與藥物最佳聯(lián)合及最小不良反應(yīng)的治療方案仍然缺乏。

人參在中國(guó)已有數(shù)千年的食用和藥用歷史，經(jīng)常被用于預(yù)防和治療多種疾病，是非常寶貴的補(bǔ)品。人參皂苷是人參的主要藥理活性成分，因其廣泛的生物活性而聞名。人參皂苷有幾種不同的化合物，包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3等。 其中最常研究的人參皂苷為Rg3、Rg1、Rb1、Rh1、Re 和Rd[3]。有研究表明，某些人參皂苷，例如Rg1、Rg2、Rg3和Rh2具有誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖或抑制遷移的抗腫瘤活性[4-5]。由于人參皂苷Rh3是稀有的人參皂苷之一，因此對(duì)其生物活性了解甚少。

本研究旨在評(píng)價(jià)人參皂苷Rh3聯(lián)合多西他賽化療對(duì)PC3 前列腺腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料

1.1 腫瘤細(xì)胞

人前列腺癌細(xì)胞PC3（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），復(fù)蘇后接種于F-12K 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液組成的培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（德朗公司，DR-200Bs）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，150iC02）；生物凈化工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司，VS-1300U）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，5424r）；4℃、－20℃和80℃超低溫冰箱（海爾公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）；顯微鏡（OPTEC 公司，TP510）；電泳槽（北京百晶生物，BG-transBLOT）；Transwell小室（353097，F(xiàn)alcon），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning 公司，25 cm2）；培養(yǎng)皿（Corning 公司，100 mm2），1.5 mL EP 管（AXYGEN，MCT-150-C）。

1.3 試藥

多西他賽（批號(hào)：D107320，規(guī)格：10 mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），人參皂苷Rh3（批號(hào)：89007，規(guī)格：20 mg，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司），WST-1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C0036，碧云天生物技術(shù)有限公司），Matrigel（批號(hào)：354234，BD），結(jié)晶紫染色液（批號(hào)：C0121）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012S）、HRP 標(biāo)記二抗（批號(hào)：A0201）（碧云天生物技術(shù)有限公司），E-cadherin 抗體（批號(hào)：20874-1，00082672，Proteintech），N-cadherin 抗體（批號(hào)：A01577-2，15D39，博士德），GAPDH 抗體（批號(hào)：60004-1，0004237，Proteintech）。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

使用WST-1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)人參皂苷Rh3和多西他賽對(duì)PC3 細(xì)胞活力的影響。在96 孔板每孔加入100 μL（2000個(gè)）PC3 細(xì)胞，人參皂苷Rh3實(shí)驗(yàn)組分別加入0、5、10、20、40、80、160 和320 μmol·L－1人參皂苷Rh3[6-7]；多西他賽實(shí)驗(yàn)組分別加入0、1、2、4、8、16、32 和64 nmol·L－1的多西他賽（用二甲基亞砜配制）[8-9]。0 濃度組為陰性對(duì)照組，加入等體積溶劑。培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL WST-1 溶液，孵育2 h，把96 孔板置于搖床上搖動(dòng)1 min，在450 nm 測(cè)定吸光度（A值）。細(xì)胞增殖抑制率 ＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值）×100%。

2.2 細(xì)胞劃痕方法

PC3 腫瘤細(xì)胞常規(guī)方法擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，用胰酶消化，制備1×106個(gè)·mL－1細(xì)胞懸液，將500 μL 細(xì)胞懸液加入預(yù)先放置隔板的24 孔板中，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、人參皂苷Rh3組（Rh3組，10 μmol·L－1）、多西他賽組（Doc 組，2 nmol·L－1）、人參皂苷Rh3和Doc 聯(lián)合用藥組（Rh3＋Doc組），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出隔板，拍攝所形成劃痕的初始寬度。加入干預(yù)藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h 和48 h 后拍攝劃痕寬度。

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)-Transwell 法

同“2.2”項(xiàng)下方法分組，用預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋Matrigel，并取40 μL 加入預(yù)冷的Transwell 小室中；將PC3 腫瘤細(xì)胞制成2×105個(gè)·mL－1含干預(yù)藥物的單細(xì)胞懸液，取200 μL體積細(xì)胞懸液加入Transwell 小室。下室加入500 mL 完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，4%多聚甲醛溶液固定25 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，晾干后包被基底膜，顯微鏡拍照后進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。

2.4 Western blot 法

同“2.2”項(xiàng)下方法分組，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。制備電泳膠，在上樣孔加入10 μL 蛋白和蛋白電泳marker，電泳并轉(zhuǎn)PVDF 膜，封閉后。分別加E-cadherin 抗體（1∶10 000），N-cadherin 抗體（1∶1000），GAPDH 抗體（1∶20 000），孵育過(guò)夜，繼續(xù)孵育HRP 標(biāo)記的二抗，HRP-ECL 發(fā)光法進(jìn)行分析并掃描。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，組間差異比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細(xì)胞增殖

人參皂苷Rh3和多西他賽處理PC3 細(xì)胞24 h的細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果見(jiàn)表1。隨著人參皂苷Rh3、多西他賽的濃度增大，PC3 細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。根據(jù)濃度梯度和細(xì)胞抑制率結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)Rh3和多西他賽分別選擇10 μmol·L－1和2 nmol·L－1濃度進(jìn)行處理。

表1 人參皂苷Rh3 和多西他賽對(duì)PC3 細(xì)胞增殖抑制率(24 h)Tab 1 Inhibition rate of PC3 cell proliferation by ginsenoside Rh3 and docetaxel (24 h)

3.2 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細(xì)胞遷移

劃痕法測(cè)細(xì)胞的遷移能力結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，細(xì)胞愈合24、48 h，與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh3組和多西他賽組明顯抑制PC3 細(xì)胞遷移（P＜0.05，P＜0.01），兩者聯(lián)合處理效果更佳（P＜0.01）。

圖1 人參皂苷Rh3 和多西他賽對(duì)PC3 細(xì)胞遷移的影響（100×）Fig 1 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on PC3 cell migration（100×）

3.3 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細(xì)胞侵襲

通過(guò)Transwell 法測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，人參皂苷Rh3和多西他賽組PC3 細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，表明人參皂苷Rh3和多西他賽明顯抑制細(xì)胞侵襲（P＜0.05），聯(lián)合處理組效果更好（P＜0.01）（見(jiàn)圖2）。

圖2 人參皂苷Rh3 和多西他賽對(duì)PC3 細(xì)胞侵襲的影響（100×）Fig 2 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on the invasion of PC3 cells （100×）

3.4 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

E-cadherin 為上皮標(biāo)記蛋白，N-cadherin 為間質(zhì)標(biāo)記蛋白，通過(guò)Western blot 法檢測(cè)兩者表達(dá)水平，進(jìn)一步說(shuō)明腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力及其分子機(jī)制。結(jié)果顯示，人參皂苷Rh3和多西他賽均能上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)水平和下調(diào)N-cadherin 蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），兩藥聯(lián)用作用效果更為顯著（P＜0.01）（見(jiàn)圖3）。

圖3 人參皂苷Rh3 和多西他賽對(duì)PC3 細(xì)胞上皮-間質(zhì)關(guān)鍵蛋白E-cadherin 和N-cadherin 表達(dá)水平的影響Fig 3 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on the expression of E-cadherin and N-cadherin in PC3 cells

4 討論

PCa 是臨床泌尿外科常見(jiàn)的惡性腫瘤，中晚期PCa 的發(fā)病率逐年升高。多數(shù)PCa 患者確診時(shí)已為中晚期，經(jīng)過(guò)內(nèi)分泌治療后，逐漸發(fā)展為去勢(shì)抵抗前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），化療是CRPC 的重要治療手段[9]。紫杉類藥物被認(rèn)為是治療PCa 最有效的化療藥物。多西他賽為紫杉醇的半合成衍生物，雖然已廣泛應(yīng)用于PCa 患者的輔助化療和CRPC 的治療[10]，但絕大多數(shù)患者在用藥過(guò)程中出現(xiàn)藥物耐藥現(xiàn)象和不良反應(yīng)[5，11]。因此，尋求一種新的有效的治療PCa 方法是有必要的。

人參皂苷是人參中最重要和最主要的藥理活性成分，研究表明，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3和Rh2具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖或抑制遷移的抗腫瘤活性[3，12]。人參皂苷Rh3在人參屬藥材中含量很低，為稀有的人參皂苷，但其制備工藝已得到大幅提升，為人參皂苷Rh3的研究和應(yīng)用提供了極大地便利[13]。

人參皂苷Rh3通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）活性、增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)和cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白激活來(lái)保護(hù)記憶受損[14]。人參皂苷Rh3通過(guò)調(diào)節(jié)5′-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用[15]。它通過(guò)激活Nrf2 來(lái)保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受紫外線的傷害[16]。人參皂苷Rh3可以抑制紫外線照射角質(zhì)形成的細(xì)胞中GMCSF 表達(dá)[17]。人參皂苷Rh3具有良好的抗腫瘤活性。在白血病中，人參皂苷Rh3使HL-60 細(xì)胞周期阻滯在G1/S 期，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化為形態(tài)和功能性的粒細(xì)胞[18]。人參皂苷Rh3能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5，19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh3能夠明顯抑制PC3 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。表明人參皂苷Rh3是一種潛在的抗PCa 細(xì)胞侵襲的藥物。人參皂苷Rh3抑制N-cadherin 表達(dá)，促進(jìn)了E-cadherin 表達(dá)，表明其可能抑制了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。EMT 在生命正常發(fā)育的各個(gè)階段以及在腫瘤細(xì)胞發(fā)生的一系列表型和分子變化中非常常見(jiàn)[20]。對(duì)于許多腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移而言，EMT 是關(guān)鍵的早期事件，而E-cadherin 的表達(dá)下調(diào)則是 EMT的標(biāo)志之一[20-21]。E-cadherin 轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制受很多因素影響，包括鋅指蛋白的Snail/Slug 家族、Twist、ZEB1、SIP1 等因子[22]。因此，人參皂苷Rh3抑制PC3 腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的上游調(diào)控分子機(jī)制是后期研究的方向。

綜上，人參皂苷Rh3可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT 過(guò)程抑制PCa 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，臨床治療中，人參皂苷Rh3不論是單獨(dú)使用或聯(lián)合化療藥物使用均具有應(yīng)用前景。但是，由于本研究限于PCa 細(xì)胞的體外結(jié)果，后期還需要進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究，為人參皂苷Rh3運(yùn)用于PCa 臨床治療打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。