鹽酸左氧氟沙星緩釋片的制備及藥物釋放影響因素的考察

鄭紅，宋立倩，房東陽（樂普制藥科技有限公司，浙江 臺州 318000）

左氧氟沙星（Levo）是第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，它是氧氟沙星的L型-光學活性異構體，Levo 的抑菌活性是外旋體的2 倍，是其右旋體的8 ～128 倍[1]。與氧氟沙星相比，Levo 對需氧的革蘭氏陽性球菌抑菌活性更強，對非典型病原體作用更強，且口服后吸收速度快，在全身組織均有分布，具有較高的生物利用度，作用更加長效，用藥安全性高[2]。其作用機制是通過抑制細菌DNA 旋轉酶的活性，阻止細菌DNA 的合成和復制而導致細菌死亡[3]。Levo 適用于敏感菌感染，對較深部位的感染療效更好。在臨床上，Levo 主要用于治療呼吸、泌尿、生殖系統及皮膚軟組織等輕至重度感染[4]。目前，國內市場上市的Levo 制劑主要有注射劑、片劑和膠囊劑，暫無市售的緩控釋制劑。另外，Levo 是一種濃度依賴性抗菌藥物[5]，其對各類細菌的最低抑菌濃度（MIC）值均較低[6]，革蘭氏陽性菌的MIC在0.06 ～64 mg·L－1，革蘭氏陰性菌的MIC在0.05 ～16 mg·L－1。

緩釋制劑相比普通制劑，可以有效控制藥物釋放，更長時間維持Levo 的有效濃度，延長藥物與細菌的接觸時間，更好的發揮藥效；并明顯減少每日服藥次數，增強患者的順應性；而普通制劑因不能控制藥物釋放在釋藥過程中容易產生較大的血藥濃度波動—— “峰谷”效應，引起患者的不良反應，嚴重者甚至可能死亡[7]。因此，將Levo 制備成緩釋片可以使血藥濃度更加平穩，增強Levo 在臨床使用中的耐受性、安全性及順應性。

因此，本實驗選擇鹽酸左氧氟沙星（Levo-HCl）為模型藥物，以羥丙甲基纖維素（HPMC）、乙基纖維素（EC）、微晶纖維素（MCC）、乳糖（Lac）為主要輔料，制備Levo-HCl 緩釋片。在臨床，根據患者的體質，成人患者的Levo-HCl片每日用量在300 ～600 mg，因此本文擬制備劑量為300 mg 的Levo-HCl 緩釋片。

1 材料

1.1 儀器

FB7015 分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TDP 型單沖壓片機（上海天翔健臺制藥機械有限公司）；RC-8DS 型藥物溶出度測定儀（天津市國銘醫藥設備有限公司）；UV-9100 型紫外-可見分光光度計（上海元析分析儀器公司）；LC-100 高效液相色譜儀（輝世儀器設備有限公司）。

1.2 試藥

環丙沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：99%，批號：130451-201904）；鹽酸左氧氟沙星原料藥（質量分數：99.8%，鄭州艾克姆有限公司）；鹽酸左氧氟沙星片（廣東彼迪藥業有限公司同，規格：100 mg/片，批號：20180512）；Levo-HCl 緩釋片（自制）；HPMC、EC（上海卡樂康公司）；MCC（鄭州艾克姆有限公司）；Lac（天津市大茂試劑廠）；硬脂酸鎂（天津市大茂試劑廠）。

2 方法

2.1 Levo-HCl 釋放度測定

按照《中國藥典》2020年版通則0931 第一法釋放度測定法，取6 片自制Levo-HCl 緩釋片，溶出溫度控制為（37.0±0.5）℃，轉速為50 r·min－1，溶出介質為900 mL 鹽酸溶液。在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 分別取溶液5 mL，并即時補充恒溫溶出介質5 mL，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液稀釋適當倍數，利用紫外-可見分光光度法，在294 nm 的波長處測定樣品吸光度，計算釋放度。

2.2 Levo-HCl 緩釋片的制備

按處方量稱取Levo-HCl（過100 目篩）、HPMC（過80 目篩）、EC（過80 目篩）、MCC（過80 目篩）、Lac（過80 目篩）并充分混合30 min，加入黏合劑（60%乙醇水溶液）適量，制備軟材，過20 目篩，所制成的濕顆粒于40℃烘箱中干燥2 h，過20 目篩整粒，再加入硬脂酸鎂適量，充分混合30 min。分別稱取500 mg 混合物料進行壓片，得到片劑，調整片劑的硬度在6 ～8 kg，片重為490 ～500 mg。

2.3 單因素考察

2.3.1 不同種類的HPMC 對藥物釋放的影響其他組分不變時，按表1中F1、F2、F3 處方進行稱量，考察不同種類的HPMC（HPMC K4M、HPMC K15M、HPMC K100M）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.2 不同用量的HPMC 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F1、F4、F5 處方進行稱量，考察不同用量的HPMC（含量分別是5%、15%、25%）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.3 不同用量的EC 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F4、F6、F7、F8 處方進行稱量，考察不同用量的EC（含量分別是0%、5%、10%、15%）對片劑中藥物釋放的影響。

2.3.4 不同比例的MCC 與Lac 對藥物釋放的影響 其他組分不變時，按表1中F7、F9、F10處方進行稱量，考察不同比例的MCC 與Lac（MCC 與Lac 比例分別是2∶1、1∶1、1∶2）對片劑中藥物釋放的影響。

表1 鹽酸左氧氟沙星緩釋片處方(%)Tab 1 Formulation of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets (%)

2.4 正交設計法優化處方工藝

在單因素考察的基礎上，將影響Levo-HCl緩釋片釋放行為的關鍵因素，利用正交實驗表[8]，以自制緩釋片與一級動力學釋放行為擬合的相關系數（r2）（n＝6）作為評價指標，評價處方的優劣。

2.5 最優處方重現性考察

按照最優處方工藝制備3 批Levo-HCl 緩釋片，對片劑的外觀、機械性質分別進行測定；按照“2.1”項下方法測定片劑中藥物的體外釋放度，并將釋放度與一級動力學的相關系數作為評價指標，采用相似因子?2法對3 批自制制劑進行批間相似性評價，以考察處方、工藝的重現性和穩定性。

2.6 Beagle 犬體內藥物動力學研究

2.6.1 樣品的采集 采用雙周期交叉給藥的實驗方案，將8 只健康Beagle 犬作為受試的實驗動物。禁食12 h 后給藥，隨機分為兩組，空腹抽取空白血4 mL。其中參比制劑為市售普通片，每次給藥3 片（每片100 mg，以C18H20FN3O4計）；受試制劑為自制緩釋片，每次給藥一片（每片300 mg，以C18H20FN3O4計），均用50 mL 溫開水送服。服藥4 h 后統一給食并自由飲水，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h 于前肢靜脈取血3 mL 置肝素抗凝管內，3500 r·min－1離心15 min。取上層血漿，將樣品放置于－20 ℃冰箱中冷凍保存備用。

2.6.2 血漿樣品的處理與測定 用1.5 mL 離心管精密稱取空白血漿0.45 mL，精密加入質量濃度 為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μg·mL－1的Levo-HCl 溶液（精密稱取Levo-HCl適量，將樣品倒于100 mL 棕色量瓶中，用HCl溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）50 μL。加入環丙沙星內標溶液（精密稱取環丙沙星對照品約30 mg，將樣品倒于50 mL 棕色量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻即得）50 μL，渦旋混勻后加入5%的高氯酸0.5 mL，渦旋1 min，離心2 次，轉速為12 000 r·min－1，每次10 min，取上清液20 μL，進樣測定，記錄樣品的色譜圖和峰面積[9]。質量濃度C為橫坐標，主藥與內標的峰面積比S為縱坐標，線性擬合得回歸方程S＝0.0586C＋0.0021，r2＝0.9908，線性范圍為0.25 ～32.0 μg·mL－1。以S/N＝10 計算，定量限為40 μg·mL－1。

用1.5 mL 離心管精密稱取含藥血漿0.5 mL，按“2.6.2”項下方法操作，記錄樣品的色譜圖，計算各時間點的血藥濃度，并用DAS 2.0 軟件程序計算藥動學參數。

3 結果

3.1 HPMC 種類對藥物釋放的影響

選擇不同種類的HPMC 制備片劑，其累計釋放情況見圖1。

圖1 HPMC 種類對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 1 Effect of types of HPMC on drug release（n ＝6）

由圖1可見，不同種類的HPMC 對藥物釋放速度的影響十分顯著，不同種類的HPMC 對于片劑的緩釋效果排名如下：HPMC K100M ＞HPMC K15M ＞HPMC K4M。這是因為不同型號的HPMC 黏度不同，隨著HPMC 黏度的增大，吸水后形成的凝膠層強度增大，凝膠層的骨架溶蝕速率減慢，藥物釋放速度明顯下降，實驗結果與相關文獻報道的結果一致[10]。另外，在釋放的初期（前2 h），3 種緩釋材料所呈現的釋放曲線行為極為相似，推測與藥物溶解度較大與沒有充足的時間形成凝膠骨架有關。另外，片劑在2 h時釋放大于50%，推測產生“突釋”現象與藥物具有良好的溶解度有關。綜合考慮，選擇在處方中加入HPMC K100M 作為緩釋材料。

3.2 不同用量的HPMC K100M 對藥物釋放的影響

選擇不同用量的HPMC K100M 制備片劑，其累計釋放結果見圖2。由圖2可見，不同用量的HPMC K100M 對于藥物釋放速率有明顯的影響，HPMC K100M 用量越多，片劑吸水后形成的凝膠層越厚，強度越大，骨架的溶蝕速率越慢，藥物釋放速度越慢。當HPMC 含量為5%時，藥物在8 h 釋放超過90%，藥物釋放過快；當HPMC 含量為25%時，藥物在12 h 時釋放80%，藥物釋放不完全，而且后期釋放速度明顯下降，藥物無法完全釋放。綜合考慮，選擇在處方中加入15%的HPMC K100M。

圖2 不同HPMC K100M 含量對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 2 Effect of different amounts of HPMC K100M on the drug release（n ＝6）

3.3 不同用量的EC 對藥物的釋放的影響

選擇不同用量的EC 制備片劑，其累計釋放結果見圖3。由圖3可知，不同用量的EC 對于藥物釋放有顯著的影響。EC 在處方中的作用是減少孔道形成。當不加EC 時，藥物釋放的最快，隨著EC 的用量增多，由HPMC K100M 形成的凝膠層的孔道變少，藥物的釋放減緩。當EC 含量為10%和15%時，片劑的溶出曲線相似，證明EC 超過10%時，對于片劑的釋放影響極小。綜合考慮，在處方中EC 的含量為10%。

圖3 不同EC 含量對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 3 Effect of different amounts of EC on the drug release（n ＝6）

3.4 不同比例的MCC 與Lac 對藥物釋放的影響

選擇不同比例的MCC 與Lac 制備片劑，其累計釋放結果見圖4。由圖4可知，MCC 與Lac在處方中起到填充劑的作用，MCC 與Lac 比例的改變對于片劑的釋放影響不大，僅有細微差距。綜合考慮，選擇填充劑MCC 與Lac 的比例為1∶1。

圖4 不同MCC 與Lac 比例對藥物釋放的影響（n ＝6）Fig 4 Effect of different ratio of MCC∶Lac on the drug release（n＝6）

3.5 正交實驗結果

根據單因素考察結果，HPMC 種類和用量、EC 用量對釋放影響較大。最終選擇HPMC K100M 用量（A）、EC 用量（B）兩個關鍵因素進行正交實驗設計，按照正交設計表進行實驗（見表2），進行兩因素三水平正交實驗，結果見表3。

表2 鹽酸左氧氟沙星緩釋片正交實驗因素水平表Tab 2 Factor and level of orthogonal experimental for levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets

表3 正交實驗分析結果(n ＝6)Tab 3 Orthogonal experimental design (n ＝6)

通過極差分析結果可知，兩種因素對體外藥物累計釋放的影響大小排序為：A ＞B，主要是因為HPMC K100M 是一種水溶性材料并且黏度較大，是緩釋片形成凝膠骨架的主要材料，HPMC K100M 的用量直接決定著凝膠層的厚度與強度，控制藥物的釋放。而EC 是一種不溶于水的材料，對于片劑起到調節釋放的作用，主要通過控制擴散路徑的多少、大小進而改變藥物的釋放速率，EC 的用量對于藥物的釋放具有一定的影響。通過直觀分析法對實驗結果進行處理，得到最優處方組成為A2B3，即HPMC K100M 的處方用量為15%，EC 的處方用量為10%。

3.6 最優處方、工藝重現性考察

基于正交設計實驗得到的最優化處方為Levo-HCl 60%，HPMC K100M 15%，EC 10%，MCC 7.5%，Lac 7.5%。以最優處方為基礎，制備3 批Levo-HCl 緩釋片，所制備的片劑外觀光澤，表面規整，機械性能（包括硬度、脆碎度）符合藥典規定，片劑的含量差異性較小，符合固體制劑相關要求。

將3 批自制緩釋片進行體外釋放度實驗，結果見圖5。采用?2相似因子法對3 批自制制劑進行批間相似性評價，結果見表4。3 批自制Levo-HCl 緩釋片的體外釋放曲線相似性良好，f2均大于50。3 批自制片在0 ～12 h 內藥物呈現緩慢釋放的趨勢，證明所得到的優化處方合理可靠，工藝穩定，重現性良好。

圖5 最優處方3 批制劑體外釋放曲線（n ＝6）Fig 5 Release profile of 3 batches of optimized formulation（n ＝6）

表4 最優處方3 批制劑體外釋放?2 (n ＝6)Tab 4 ?2 of 3 batches of optimized formulation (n ＝6)

3.7 Levo-HCl 緩釋片在Beagle 犬體內藥動學研究

3.7.1 藥動學參數及計算 將平均血藥濃度（C）對時間（t）作圖，結果如圖6所示；采用DAS 2.0 藥物動力學軟件對不同時間點的血藥濃度數據進行非隔室模型擬合，計算主要藥動學參數，結果如表5所示。

圖6 Levo-HCl 緩釋片平均血藥濃度-時間曲線（n ＝8）Fig 6 Mean plasma concentration-time curve of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet（n ＝8）

表5 Levo-HCl 緩釋片主要藥動學參數(x ±s，n ＝8)Tab 5 Main pharmacokinetic parameters of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablet (x ±s，n ＝8)

3.7.2 體內外實驗相關性評價 生物利用度是考察藥物制劑質量是否合格的重要指標之一，但生物利用度的測定要求較高，常需要在人體內進行實驗研究，無法作為一般產品的質量控制手段。而體外釋放在很大程度上可以反映藥物在體內吸收情況，但需證明其合理性，即體外釋放度與生物利用度具有良好的相關性。根據查閱相關文獻可知[11-12]，可以通過擬合處理體外累計釋放度與體內吸收分數（Fa）得到兩者相關性。

體內吸收分數主要根據給予某種制劑后測定血藥濃度-時間的數據得到（見表6），根據Wagner-Nelson 方程計算，公式如下：

表6 鹽酸左氧氟沙星緩釋制劑的血藥濃度(x±s，n ＝8)Tab 6 Plasma concentration of levofloxacin hydrochloride sustained-release preparation (x±s，n ＝8)

Fa＝（Ci＋KeAUC0→t）/KeAUC0→∞×100%

其中Ci為t時間下的血藥濃度；Ke為消除速率常數。

采用表7中自制緩釋片體外釋放百分率（Fr）與Fa進行線性回歸，可得回歸方程為Fa＝1.1106F＋0.1397（R2＝0.9906），結果表明F與Fa具有良好的相關性，體外釋放度可以在一定程度上反映藥物在體內的吸收情況。

表7 鹽酸左氧氟沙星緩釋制劑藥物釋放體內外相關性Tab 7 Drug release of levofloxacin hydrochloride sustained-release tablets in vitro and in vivo

3.7.3 相對生物利用度計算 以非隔室模型統計結果中的AUC0→t數據，計算與參比制劑同劑量的Levo-HCl 緩釋片的相對生物利用度（F）。

相對生物利用度計算公式如下[13]：

F＝[AUC0→t（T）/DT]/[AUC0→t（R）/DR]×100%

其中，T、R 分別代表受試片和參比緩釋片。

經計算可知，自制Levo-HCl 緩釋片對市售片Beagle 犬體內的平均相對生物利用度為91.61%。

4 結論

本文的模型藥物為Levo-HCl，通過正交設計制備具有良好緩釋能力的凝膠骨架片。采用單因素實驗確定了影響藥物釋放的重要因素，并以自制片與一級動力學釋放行為的相關系數作為評價指標，采用正交實驗設計對處方工藝進行優化，最佳處方組成為Levo-HCl 60%、HPMC K100M 15%、EC 10%、MCC 7.5%、Lac 7.5%。最終自制Levo-HCl 緩釋片在12 h 內呈現一級藥動學釋放特征，可降低血藥濃度波動。同時自制片在Beagle 犬的藥動學研究結果表明，自制Levo-HCl緩釋片與市售普通片相比，具有緩釋效果，相對生物利用度為91.61%。