HPLC-Q-TOF-MS/MS法分析防己茯苓湯的化學成分

劉楊，楊玉佩，沈冰冰2，*（1.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2.湖南省中醫藥研究院 中藥研究所，長沙41001；.湖南中醫藥大學，長沙 410208）

防己茯苓湯是由防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草五味中藥組成，來源于《金匱要略》中的水氣病脈證篇，具有益氣健脾、溫陽利水之功效。現代臨床主要用于治療由脾心陽虛濕盛所致之水腫、慢性充血性心力衰竭、尿毒癥和系統性紅斑狼瘡等[1-3]；也有在此方基礎上進行加減味的復方，用于治療腎病綜合征、乳腺癌、帕金森等疾病[4-5]。但是有關復方防己茯苓湯全成分的化學分析報道較少，因此采用現代中藥分析技術手段對其開展化學成分的研究迫在眉睫。其中，HPLC-Q-TOFMS/MS 具有高分辨、高靈敏度等特點，可快速獲得目標物的分子離子峰和特征碎片離子，從而對復方中不同類型的化合物進行定性分析[6-7]。本研究首次采用HPLC-Q-TOF-MS/MS 對防己茯苓湯的化學成分進行分析與鑒定，以期為復方的質量控制以及藥效物質的深入研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 infinity 超高效液相色譜儀、Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS/MS 質譜儀（美國安捷倫公司）；Mettler Toledo AL204 型電子天平、Mettler Toledo XPE105 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），KM-500DB 型中文液晶臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈色譜純（德國Merck 公司），甲酸[色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]，水為純凈水[華潤怡寶飲料（中國）有限公司]，其余試劑均為分析純。中藥材防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草均購自湖南省自然堂中藥飲片有限公司，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所助理研究員沈冰冰鑒定為防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore 的干燥根，豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝，多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根。粉防己堿（純度≥99.6%，批號：110711-201810）、防己諾林堿（純度≥98.3%，批號：110793-201807）、去甲異波爾定（純度≥96.9%，批號：111825-201201）、黃芪甲苷（純度≥96.9%，批號：110781-201717）、甘草苷（純度≥93.1%，批號：111610-201607）、毛蕊異黃酮苷（純度≥98.1%，批號：111920-201606）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 供試品溶液的制備 按防己茯苓湯處方比例（30∶30∶30∶40∶20）取防己、黃芪、桂枝、茯苓和甘草五味中藥，分別按以下3 種方法進行制備：方法一加水600 mL 煎煮2 h；方法二加75%甲醇600 mL 回流提取2 h；方法三加75%甲醇600 mL 超聲提取（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min。分別提取完成后，過濾，減壓濃縮至適量，定容至100 mL。搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即可。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱量對照品粉防己堿5.16 mg，防己諾林堿5.23 mg，去甲異波爾定5.05 mg，黃芪甲苷 5.11 mg，甘草苷5.03 mg，毛蕊異黃酮苷5.27 mg，75%甲醇超聲溶解，定容至25 mL 量瓶中。于4℃ 冰箱中避光保存，備用。進樣前過微孔濾膜。

2.2 色譜和質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相A 為0.1%甲酸水，B 為甲醇，梯度洗脫（0 ～7 min，2%B；7 ～25 min，2% ～30%B；25 ～40 min，30% ～35%B；40 ～48 min，38%B；48 ～60 min，38% ～72%B；60 ～80 min，72%B；80 ～85 min，72% ～100%B）， 進樣量5 μL，流速1.0 mL·min－1，柱后分流檢測，分流比為10∶1；柱溫30℃。

2.2.2 質譜條件 離子化方式電噴霧離子化（ESI），在正、負離子模式分別采集，干燥氣溫度320℃，干燥氣體積流量為8.0 L·min－1，鞘氣溫度350℃，毛細管電壓3.5 kV，碎片電壓145 V，碰撞能量分別采用 5、10、20、30、40 eV，質量數范圍為m/z50 ～1200。

3 結果與分析

3.1 不同制備方法的對比

對3 種不同制備方法的樣品分別進行HPLCQ-TOF-MS 檢測分析，得到總離子流圖（TIC）如圖1所示。通過對比分析色譜峰的數目以及制備方法的時間，最終確定采用方法三進行制備。

圖1 3 種不同制備方法的TIC 圖Fig 1 Total ion chromatogram of 3 different preparation methods

3.2 成分鑒定

對方法三得到的防己茯苓湯進一步進行HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，分別得到正負離子模式下的總離子流圖，結果如圖2所示。結合對照品裂解規律以及相關文獻資料對目標化合物進行分析鑒定，最終確定了36 個化合物，包括7個生物堿類，13 個萜類化合物，11 個黃酮類化合物，見表1。

圖2 防己茯苓湯在正負模式下的TIC 圖Fig 2 Total ion chromatogram of Fangji Fuling decoction in positive ion mode and negative ion mode

表1 防己茯苓湯的化學成分的HPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定Tab 1 Identification of chemical constituents of Fangji Fuling decoction by HPLC-Q-TOF-MS/MS

續表1

3.2.1 生物堿類 所有生物堿類化合物均來自植物粉防己，主要類型有雙芐基異喹啉類、原小檗堿類和阿樸啡類生物堿等[9]。研究發現該類化合物只出現在正離子模式下，其中雙芐基異喹啉類是頭對頭雙二苯醚雙芐基四氫異喹啉類，這類成分的結構特征主要是尾部的二苯醚鍵是C-3′與C-4′連接，頭部是C-7 與C-8′連接，其質譜裂解特點就是雙芐基的裂解。化合物10和13 的分子離子峰分別為609.2961[M ＋H]＋、623.3088[M ＋H]＋，雙芐基的丟失生成特征離子m/z381 和m/z395，另外還有m/z190、m/z174、m/z160 等碎片離子的出現，具體裂解規律如圖3所示。對比對照品，確定化合物分別為粉防己堿和防己諾林堿。

阿樸啡類生物堿根據N 上是否有甲基，會產生M-43 或M-29 的特征碎片離子峰，并且會出現失去一系列取代基（-OCH3，-CH3，-OH）的離子峰。化合物5 和8 的分子離子峰為342[M ＋H]＋，比較兩者二級質譜裂解均出現299[M ＋H-C2H5N]＋，327，324 和310 等碎片離子，如圖4所示。對比文獻和保留時間確定化合物5 和8 分別為異紫堇定堿、紫堇定堿[10]。化合物6 具有和紫堇定堿一致的裂解規律，只是分子離子峰328.1568[M ＋H]＋相差14 Da，故確定該化合物為波爾定堿或異波爾定堿。而化合物7 產生了N 上沒有甲基的M-29 特征碎片離子，對比對照品，確定化合物為去甲異波爾定。

圖4 紫堇定堿的質譜裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of corydine

3.2.2 三萜類 復方中的三萜主要來源于茯苓、黃芪和甘草。其中，茯苓中的三萜主要是羊毛甾烷型三萜酸，根據3、4 位是否開環及碳碳雙鍵的位置主要分為四大類[15]：羊毛甾-8 烯型（Ⅰ型）、羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅱ型）、3，4 開環-羊毛甾-8 烯型（Ⅲ型）和3，4 開環-羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅳ型）。分子離子峰在正負模式下都有較強的響應，主要以[M-H]－、[M ＋H]＋等形式存在。在二級質譜下，其裂解主要是由于C-3、C-16 和C-17 位上取代基的斷裂引起的，并且3，4 開環類化合物與C-1 位相連的鍵極易斷裂。化合物24 在ESI（＋）模式下響應較高，會丟失碳3、16、17 位上的取代基，生成相應的碎片離子峰469[M ＋H-C2H4O2]＋、511[M ＋H-H2O]＋、373[M ＋H-C9H16O2]＋，最終產生m/z295 的Ⅰ型特征離子；而化合物23 和25 產生的是Ⅱ型特征離子m/z293，如圖5所示，對照文獻[16]確定化合物24、23 和25 分別為茯苓酸、去氫茯苓酸和去氫齒孔酸。另外，化合物18，21和22 都屬于Ⅳ型，在ESI（＋）模式下，17 位上的取代基丟失并同時失去一分子H2O 得到Ⅳ型特征離子m/z325，對照文獻[15]確定分別為茯苓新酸 E、茯苓新酸 D 和茯苓新酸 B。

圖5 茯苓Ⅰ型和Ⅱ型三萜的質譜裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathway of pachymic acid（type I）and dehydropachymic acid（type Ⅱ）

黃芪是一類較特殊的環阿屯烷型三萜皂苷，與羊毛甾烷型的差別在于C-10 位的甲基和C-9位脫氫形成三元環[18]。化合物30 分子離子峰807.4488[M ＋Na]＋會連續丟失一分子葡萄糖和一分子木糖，形成環黃芪醇骨架離子437 [M ＋H-Glc-Xyl-3H2O]＋，然后與17 位相連的E 環會斷裂生成m/z125 特征碎片離子，這與對照品黃芪甲苷的裂解途徑一致。此外，化合物28、33和34 也均產生了m/z437 和m/z125，對照參考文獻[11]和保留時間分別確定為astrasieversianinⅡ、黃芪皂苷 Ⅱ和黃芪皂苷Ⅰ。

甘草中的三萜主要是齊墩果烷型，在ESI（＋）模式下主要以[M ＋Na]＋、[M ＋H]＋形式存在。在二級質譜裂解過程中，主要是糖鍵的連續性斷裂以及取代基的丟失。化合物29 的分子離子峰為845.3883[M ＋Na]＋，在ESI（＋）模式下會連續失去兩分子葡萄糖醛酸生成647[M ＋H-C6H8O6]＋和471[M ＋H-C12H16O12]＋， 然后母核的C 環發生RDA 裂解， 生成m/z263 和m/z209 兩個特征碎片離子，從而確定化合物為甘草酸。化合物35 和36 的分子離子峰分別為823.4146 [M ＋H]＋和825.4380[M ＋H]＋，也會連續失去兩個葡萄糖醛酸，得到m/z471 和m/z473 的骨架離子，但其具體取代位置無法確定，對照文獻[12]確定化合物35 和36 為甘草皂苷K2和J2或其異構體。

3.2.3 黃酮類 黃芪中的化合物14、17、31 和32 都屬于異黃酮類化合物。研究發現該類化合物在ESI（＋）模式下豐度較大，出現[M ＋Na]＋和[M ＋H]＋分子離子峰，并且其裂解規律與黃酮類差別不大，主要是C 環的RDA 裂解。化合物14 的分子離子峰469.1093[M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖形成母核285[M ＋H-Glc]＋，然后4′位的-OCH3容易丟失形成m/z255，最后發生RDA 裂解形成m/z137 的特征碎片例子。其裂解途徑與對照品一致，故確定為毛蕊異黃酮苷。

甘草中的黃酮主要包括黃烷酮類、二氫黃酮類、查爾酮類等類型。黃烷酮類化合物主要是C環的RDA 裂解和B 環的斷裂；而二氫黃酮類中A 環和B 環間連接的各個鍵都肯可能會裂解，從而產生相應的碎片離子。化合物11 在ESI（＋）模式下響應較高，發生RDA 裂解產生m/z137 的特征碎片離子峰，另外還出現257[M ＋H-Glc]＋，163[M ＋H-Glc-C6H6O]＋等離子峰，如圖6所示，通過與甘草苷對照品的裂解途徑對比，確定該化合物為甘草苷。化合物15、19 和20 是甘草苷的同分異構體。化合物15 的分子離子峰為441.1148 [M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖[M ＋H-Glc]＋后，A 環發生裂解得到二氫黃酮類的特征離子m/z109，對照文獻[14]確定化合物為異甘草苷。根據極性大小與保留時間，化合物19 與20分別確定為新甘草苷和新異甘草苷。化合物16 與異甘草苷的裂解規律一致，僅多了個失去芹糖的離子峰419[M ＋H-Apiose]＋，因此確定該化合物為芹糖異甘草苷。

圖6 甘草中甘草苷的質譜裂解途徑Fig 6 Fragmentation pathway of liquiritin

4 討論

本試驗考察了3 種不同制備方法，最終采用75%甲醇超聲提取法，并且首次對防己茯苓湯的化學成分進行HPLC-Q-TOF-MS/MS 快速分析。研究發現各成分在ESI（＋）模式的響應較強，所以本試驗主要針對正模式下的質譜裂解規律進行了分析總結，最終對比對照品以及相關參考文獻，共鑒定了36 個化合物，包括7 個生物堿類，13 個萜類化合物，11 個黃酮類化合物。其中，來源于防己的有7 個，茯苓有6 個，黃芪有9 個，甘草有11 個，桂枝有1 個，且大部分化合物都是各自中藥的特征成分。但是來源于桂枝的較少，可能與其主要成分是揮發油有關。另外，質譜解析過程中也存在大量同分異構體，在無對照品的支撐下無法確定，需要其他手段進一步深入研究。本試驗運用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術方法，對復方防己茯苓湯的主要化學成分進行了詳細研究，這對復方的質量控制及藥效物質基礎的進一步研究具有重要意義。