包載姜黃素的羧甲基化白及多糖-殼聚糖聚電解質復合膜對大鼠口腔潰瘍的治療作用研究

王玉蓉，巨佳，王濟，趙慧雯，林瑤，黃靜，薛曉娟，馮斌，成黎霏*（.軍事口腔醫學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，陜西省口腔生物工程技術研究中心，第四軍醫大學口腔醫院 藥劑科，西安70032；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 72046）

口腔潰瘍屬于中醫中口瘍、口瘡的范疇[1]，是一種常發生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，通常具有自發性和復發性[2]。口腔潰瘍會導致疼痛，嚴重影響患者飲食和說話，降低患者的生活質量[3-4]。

姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科植物姜黃的干燥根莖中提取的主要有效成分。研究發現其具有抗炎、抗病毒、抗感染等藥理活性，且不良反應少[5]。近幾年有研究表明Cur 對口腔疾病牙周炎[6]和口腔潰瘍[7]等有顯著效果。但因其幾乎不溶于水，生物利用度低，限制了其臨床應用。

本課題組前期采用生物可降解性的白及多糖（Bletilla striatapolysaccharide，BSP）和殼聚糖（chitosan，CS）為原材料，通過醚化法[8]對BSP進行羧甲基化改性，改性后的BSP 與帶正電的CS 通過靜電作用[9]形成聚電解質復合物，制備了用于治療口腔潰瘍的載有Cur 的羧甲基化白及多糖-殼聚糖（CMBSP-CS）聚電解質復合膜。

本研究采用冰醋酸灼傷化學方法[10]建立大鼠口腔潰瘍模型，通過HE 染色法考察前期制備的包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜[11]對大鼠口腔潰瘍愈合的影響，通過ELISA法檢測各組大鼠血清和組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的變化，以期明確CMBSP-CS 對大鼠口腔潰瘍的治療作用及其可能的作用機制，為該制劑的應用研發提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠72 只，體質量（200±20）g [第四軍醫大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（軍）2012-0007]。

1.2 試藥

包載Cur 的CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜[實驗室自制，平均厚度為（74.0±2.0）μm，載藥量為95.41%，體外累積釋放度可達93.78%]，空白膜（實驗室自制）；大鼠TNF-αELISA 試劑盒（F18960）、IL-6 ELISA 試劑盒（F1887）、IL-1βELISA 試劑盒（F1917）、BCA 試劑盒（W1117）（上海西唐生物科技有限公司）；山羊封閉血清（中杉金橋）；Triton（Sigma 公司）；NP-40 裂解液、P0413F（上海碧云天）；醋酸（批號：190522，富宇精細化工）；生理鹽水（批號：190506，山東科倫）；水為純化水（實驗室自制）；水合氯醛、多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

DW-86L386－80℃超低溫冰箱（海爾）；Leica RM2125RTS 石蠟切片機（德國徠卡）；AX-84 光學顯微鏡（日本Olympus）；DENLEY DRAGON Wellscan MK3 酶標儀、Wellwash 4 MK2洗板機（芬蘭Thermo）；PYX-DHS，4002×500數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；TGL-168、11-07 離心機（上海安亭科學儀器廠）；20 ～200 μL 移液槍（Thermo labsystems）；XW-80A 漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；DHG-9023A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；0.1 ～50 mL 連續分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group）；高通量組織研磨器（寧波新芝）。

2 方法

2.1 動物模型的建立

將72 只雄性大鼠放在晝夜交替、溫濕度分別為（24±2）℃和40%～60%的房間適應性飼養1 周后稱重，隨機分成正常組、模型組、空白膜組和藥膜組，每組18 只。模型組、空白膜組和藥膜組用 10%水合氯醛溶液按照0.3 mL/100 g腹腔注射給藥用于麻醉，將直徑為 5 mm 的脫脂棉球塞入內徑為0.5 cm 的移液槍槍頭中，用50 μL 50%醋酸溶液浸潤后垂直緊貼于大鼠下唇口腔黏膜表面處，持續按壓 60 s 后移除棉球并用 5 mL 生理鹽水連續沖洗，以此建立大鼠口腔潰瘍模型。正常組則使用生理鹽水代替，其余操作不變。造模 24 h 后，觀察大鼠造模區局部黏膜的情況，如果形成約為0.5 cm 的潰瘍，且周圍有充血、紅腫和假膜則表明潰瘍成功形成[12-13]。

2.2 給藥方法

大鼠在給藥前，采用10% 的水合氯醛腹腔麻醉，將空白復合膜與CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜裁剪為0.5 cm2大小備用，給藥時貼于大鼠口腔潰瘍患處，輕壓20 s 以保證膜劑與患處貼合緊密。造模成功當日開始給藥，每日給藥一次，連續給藥7 d。正常組與模型組麻醉后不做處理。用藥后2 h 內禁食禁水，其余時間自由進食進水[12]。

2.3 大體觀察

造模成功后觀察動物外觀、精神及一般狀況的變化，肉眼觀察各組潰瘍愈合程度，每日測量并記錄大鼠體質量的變化。

2.4 大鼠潰瘍局部組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量測定

各組于造模成功后第3日和第7日各隨機選取6 只動物眼眶取血后處死。待血液凝固后，4000 r·min－1離心5 min，分離血清，分裝保存于－80℃備用。藥膜組、空白膜組和模型組切取潰瘍組織黏膜，正常組切取正常黏膜，用預冷的生理鹽水沖洗組織以去除殘留血液，將黏膜剪碎后置于 EP 管中稱重后加入NP-40 裂解液，用細胞超微粉碎機對黏膜進行充分粉碎。將粉碎得到的組織勻漿置于高速離心機中4℃、5000 r·min－1離心20 min 后用移液器移取上清液后分裝保存于－80℃冰箱中備用，按 ELISA 試劑盒說明書操作進行上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測定。

2.5 潰瘍組織病理學觀察

各組于造模成功后第3日與第7日各隨機選取3 只大鼠處死取得黏膜標本后，將黏膜標本用生理鹽水沖洗干凈后立即放入 4%多聚甲醛溶液進行固定，用石蠟對組織進行包埋后，連續4 μm切片，HE 染色，然后在光學顯微鏡下觀察分析。

2.6 統計分析

應用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。數據均以±s表示，兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。Sigma Plot 12.5 軟件作出圖像分析。

3 結果

3.1 CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜對口腔潰瘍愈合的作用

3.1.1 大體觀察 對大鼠精神狀況、毛發和運動的觀察采用盲法進行，觀察結果顯示，正常組大鼠反應靈敏，背毛光澤，二便和活動正常；模型組大鼠反應遲鈍，口唇邊潮濕，流口水，毛發粗糙分叉，大便偏稀；給藥組反應靈敏，背毛光澤，活動正常。

3.1.2 體質量變化 造模第3日，與正常組比較，模型組、藥膜組與空白膜組大鼠體質量變化顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，藥膜組體質量變化顯著升高（P＜0.05）。說明醋酸處理使大鼠產生疼痛與不適導致了大鼠體質量下降，給予一次藥膜能夠減少大鼠的體質量下降。

第4日，與模型組相比，藥膜組大鼠體質量變化顯著升高（P＜ 0.05），與正常組相比差異無統計學意義。結果提示，給予兩次藥膜處理能夠使大鼠體質量變化恢復到正常水平。第5日，與模型組相比，空白膜組大鼠體質量變化有顯著上升趨勢，與正常組相比差異無統計學意義（P＜0.05）。

第6 ～8日，各組大鼠體質量間差異均無統計學意義，提示實驗開始6 d 后口腔潰瘍對大鼠體質量的影響消失（見圖1）。

3.1.3 創面愈合情況 成功建模后第 3、5、7日分別觀察各組大鼠口腔潰瘍情況（觀察前用純凈水沖洗各組潰瘍處，去除藥膜等殘留物以便觀察）。結果顯示，正常大鼠各時間點口腔黏膜表面光滑，無水腫，無充血現象（見圖2A ～C）；建模后第3日，模型組、空白膜組和藥膜組造模區黏膜水腫，形成黃白色假膜（見圖2D、G、J）。建模后第 5日，空白膜組黃白色假膜變薄（見圖2H）；藥膜組黃白色假膜已經完全脫落，腫脹程度減輕，組織周圍充血減輕（見圖2K）；建模后第7日，模型組黃白色假膜未完全脫落（見圖2F）；空白膜組黃白色假膜完全脫落（見圖2I）；藥膜組有明顯的愈合現象，腫脹現象基本消失，周圍組織充血消失（見圖2L）。結果表明，藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快，說明載藥復合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合；其次為空白膜組，說明膜材中的CMBSP-CS 對口腔潰瘍的愈合有一定的促進作用；最后為模型組，驗證了口腔潰瘍具有自愈性。

圖2 不同處理組大鼠口腔潰瘍發展過程Fig 2 Development of oral ulcers in rats in different treatment groups

3.2 組織病理學觀察

由圖3可知，正常組大鼠口腔黏膜上皮完整連續，無血管充血和炎性細胞浸潤等病理改變（見圖3A、B）。造模成功后第3日，除正常組外，其余各組大鼠黏膜皮層、棘層、基底層均破壞消失，固有層直接暴露，細胞出現空泡變性，潰瘍部位有大量的炎性細胞浸潤，同時有少量的紅細胞外滲（見圖3C、E、G）；第7日，模型組基底細胞層開始呈現修復反應，但炎性細胞浸潤依舊明顯（見圖3D）；空白膜組有新的肉芽組織產生，但仍有明顯的炎性細胞浸潤（見圖3F）；藥膜組潰瘍部位棘層、基底層逐漸修復，炎癥細胞浸潤明顯減少，黏膜組織結構趨于完整（見圖3H）。結果表明，藥膜組口腔潰瘍愈合速度最快，其次為空白膜組，說明載藥復合膜治療能夠明顯加速口腔潰瘍的愈合，膜材中的CMBSP-CS 對口腔潰瘍的愈合也有一定的促進作用。

圖3 口腔黏膜 HE 染色圖片（100×，n ＝3）Fig 3 HE staining picture of oral mucosa（100×，n ＝3）

3.3 大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的檢測

由圖4可知，造模成功后第3日，與正常組相比，模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著增加（P＜0.05）造模成功后第7日，與正常組相比，模型組、空白膜組、藥膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量仍顯著增加（P＜0.05），但與第3日比較含量有所下降；與模型組相比，藥膜組與空白膜組口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量顯著下降（P＜0.05），其中藥膜組效果顯著優于空白膜組（P＜0.05）。結果顯示，給予6 次藥膜處理對大鼠潰瘍組織和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量減少的影響最為顯著，其次為空白膜組，最后是模型組，結果也表明口腔潰瘍具有自愈性。

圖4 大鼠口腔潰瘍組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量（± s，n ＝6）Fig 4 Content of TNF-α、IL-1β、IL-6 in rat oral ulcer tissue and serum（± s，n ＝6）

4 討論

本研究以醋酸化學灼傷建立的創傷性口腔潰瘍大鼠模型為實驗對象，通過大體觀察、創面愈合情況及組織病理學觀察評價CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜與空白膜對口腔潰瘍的治療作用，研究結果顯示CMBSP-CS 載藥復合膜及空白膜對口腔潰瘍均有一定的治療作用，載藥復合膜的效果最為明顯，說明空白膜可以協同Cur 一同起到治療口腔潰瘍的作用，載藥復合膜是一個藥輔合一的制劑，具有很高的臨床應用價值。研究中觀察到CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜能夠減少口腔潰瘍大鼠的體質量下降，推測載藥復合膜可能產生了一定的鎮痛效果，Cur 是中藥姜黃中的有效成分之一，《中國藥典》中記載：“姜黃可用于胸脅剌痛，閉經，徵瘕，風濕肩臂疼痛，跌撲腫痛”。說明可能與Cur 的鎮痛作用有關；多次給予空白復合膜能夠使大鼠體質量變化恢復到正常水平，這可能與膜材中CMBSP-CS 的抗炎、抗菌作用及CS 提高免疫力等作用有關。

本研究還通過大鼠口腔潰瘍組織和血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的檢測對CMBSP-CS載藥聚電解質復合膜的口腔潰瘍治療作用機制進行了初步探索，結果表明CMBSP-CS 載藥聚電解質復合膜可明顯降低口腔潰瘍組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平[14-18]，從而減少炎癥的發生，但是其分子免疫機制和對口腔潰瘍中其他因子的影響尚不清楚。下一步課題組將圍繞其是否具有鎮痛作用及具體的作用機制繼續進行研究。