基于網絡藥理學的福建野鴉椿果三萜抗肝纖維化的藥效機制研究

蔣佩佳，洪譯，譚洋，周峰，肖錦仁*，裴剛，2*（.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 40208；2.湖南省中藥飲片標準化與功能工程技術中心，長沙 40208）

肝纖維化（liver fibrosis）是肝臟對各種病因所致慢性肝損傷的過度修復反應，是以膠原為主的細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）在肝內的過度沉積，導致的肝臟結構改變和肝功能喪失[1]。據報道，肝纖維化的發病率和病死率在全世界范圍內居高不下，并呈逐年增高的趨勢[1]。在醫學上肝纖維化被認為是可逆性病變，因此，有效控制肝纖維化環節對預防肝硬化及肝癌的發生有重要的意義[2-3]。

福建野鴉椿果（Euscaphis fukienensisHsu.）為省沽油科野鴉椿屬福建野鴉椿的成熟果實，在我國南方大部分地區都可采集，主要分布于福建，常作為園林綠化植物大面積種植，資源十分豐富[4]。在我國南方地區，福建野鴉椿果的水提物經常被用來治療肝炎和肝纖維化[5-6]，但是其物質基礎和作用機制尚未明確。本課題組前期從福建野鴉椿果中分離得到了多個化合物[3，7]，其中齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分有大量關于抗肝纖維化的活性報道[8-15]，推測三萜可能是其抗肝纖維化的有效成分。因此本實驗研究福建野鴉椿果三萜類（EFT）化合物對肝纖維化小鼠的影響。

網絡藥理學基于系統生物學和經典藥理學等多學科理論，提供了一種多角度分析藥物干預疾病作用靶點及機制的系統方法[16-17]。故本研究應用網絡藥理學分析方法，對EFT 抗肝纖維化的藥效機制進行分析和預測，為該藥物抗肝纖維化藥效和機制的研究提供了依據。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030A，上海一恒科技有限公司）；超聲波清洗器（SB25-12D，寧波心芝科技股份有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-501A）、循環水式真空泵（SHZ-D）（鞏義市予華有限責任公司）；電子分析天平（AY220，日本SHIMADZU）；超級生化分析儀（日本日立）；超級化學發光免疫分析儀（美國Thermo）。

1.2 試藥

福建野鴉椿果于2016年采集于福建省三明市，經湖南中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為省沽油科野鴉椿屬福建野鴉椿的成熟果實。陽離子交換樹脂、大孔吸附樹脂D101（長沙承禹化工有限公司）；有機試劑（EtOH、CHCl3等，AR，天津恒興試劑有限公司）；蒸餾水為自制；血清谷丙轉氨酶（ALT）測定試劑盒（批號：C052-a）、谷草轉氨酶（AST）測定試劑盒（批號：B014）、白蛋白（ALB）測定試劑盒（批號：C008-a）、總膽紅素（TBIL）測定試劑盒（批號：C004-g）（中國長春匯利生物技術有限公司）；血清透明質酸（HA）定量評估試劑盒（批號：CSB-E04805h）、層粘連蛋白（LN）定量評估試劑盒（批號：CSB-E04644h）（美國CUSABIO）。

1.3 實驗動物

SPF 級昆明小鼠（14.0 ～18.0 g），雌雄各半[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2011-0005]。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心[許可證編號：SYXK（湘）2013-0003]。

1.4 數據庫及軟件

通用蛋白質數據庫UniProt（https：//www.uniprot.org/），有機小分子生物活性數據庫Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），治療靶標數據庫TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp），HPO 數據庫（https：//hpo.jax.org/），藥物銀行數據庫DRUGBANK（https：//www.drugbank.ca/），在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM（https：//omim.org/），蛋白質互作平臺STRING V 11.0（https：//string-db.org/），生物學信息注釋數據庫DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/），網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.7.2（http：//cytoscape.org/）。

2 方法

2.1 動物實驗方法

2.1.1 EFT 的制備 取干燥福建野鴉椿果1000 g，粉碎，加2000 mL 95%乙醇加熱回流提取60 min，提取3 次，合并提取液，回收乙醇，得濃縮液。將濃縮液過大孔樹脂D-101 色譜柱（柱體積約2000 mL），水洗后依次用50%和70%乙醇梯度洗脫，收集70%乙醇的洗脫部分，減壓回收溶劑，蒸至浸膏，得EFT 14.0 g，于4 ℃保存備用。取適量EFT 溶解，參照楊潔等[18]的方法，利用紫外分光光度計測定EFT 中三萜的含量。

2.1.2 動物造模及給藥處理 小鼠適應性喂養1 周后，參照文獻方法誘導肝纖維化的生成進行[5-6]。具體操作如下：除空白組外，其余各組小鼠腹腔皮下注射40% 四氯化碳（CCl4）溶液（溶于花生油）0.1 mL/10 g，每5日干預一次，共6周，首次干預劑量加倍。空白組于相同時間點，采用相同給藥方式注射等劑量花生油。

造模結束后，空白組和模型組中的小鼠按照體重，每日灌胃生理鹽水0.1 mL·10 g－1。陽性組每日灌胃秋水仙堿0.1 mg·kg－1。EFT 組每日灌胃EFT 5.12 mg·10 g－1。每只小鼠的給藥體積為0.2 mL/10 g，共給藥6 周。最后一次給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，眼眶取血分離血清，用于肝功能指標和纖維化因子的檢測。取血后將小鼠頸部脫臼處死，沿腹部正中線剪開小鼠腹部，取出肝臟，用于病理切片的檢測。

2.1.3 肝組織病理學觀察 肝組織經10%甲醛固定，蠟塊包埋，切成4 μm 厚的切片，HE 染色，100 倍光學顯微鏡下DMR ＋Q550 圖像分析儀觀察肝纖維化形成情況。

2.1.4 肝功能及纖維化生化指標的檢測 在室溫下凝結20 min 后，將血液離心10 min（3000 r·min－1），并收集上清液。檢測ALT、AST、ALB 和TBIL 水平。用ELISA 法檢測血清HA 和LN。將含有40 μL 稀釋劑的10 μL 樣品添加到平板中，振動30 s，37℃孵育30 min，用洗液洗滌5 次，添加100 μL 酶標記液，重復孵育和洗滌操作，添加發光底物，并按說明書通過超級化學發光免疫分析儀進行檢測。

2.1.5 統計分析方法 實驗數據以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 19.0 軟件處理數據，各項指標多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）并繼以最小顯著差（LSD-t）檢驗比較組間差異，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2.2 網絡藥理學方法

2.2.1 藥物和疾病靶點的篩選 查閱野鴉椿屬相關文獻[7]，以目前福建野鴉椿果中分離并鑒定結構的三萜化合物為對象，在Pubchem 數據庫中獲取這些成分的SMILE 式。將三萜活性成分的SMILE 式輸入SWISS 數據庫中獲取其作用靶點，并將靶點數據進行去重整合[16-17，19]。經過去重整合后，將靶點名稱輸入UniProt 數據庫，獲得其相應靶點的人源的靶點基因名稱及其ID。在HPO、DRUGBANK、OMIM 數據庫中，以“liver fibrosis”和“hepatic fibrosis”為關鍵詞對肝纖維化相關靶點進行檢索[20]。

2.2.2 交互網絡的構建和分析 將EFT 成分、藥物靶點、疾病靶點輸入STRING 數據庫，選定物種為人，進行蛋白互作分析。將蛋白互作分析結果（tsv 格式）導入Cytoscape 3.7.2 繪制相互作用網絡，運用軟件自帶的Tools 分析功能，分析得到度值（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC），將DC ≥2 倍中位數、BC和CC ≥1 倍中位數的靶點作為重要靶點[19，21]。

2.2.3 生物過程與通路分析 在DAVID 數據庫中輸入“2.2.2”項所得的重要靶點，選定物種為人，進行基因本體論（GO）分析和KEGG 通路富集分析[20，22]。設定閾值P＜0.05，收集P值前列的生物過程和通路，通過GraphPadPrism8.0軟件進行繪圖后，然后進行解析說明[21]。

3 結果

3.1 EFT 對小鼠肝纖維化的影響

經檢測，EFT 含量為（98.15±1.30）%。如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠的血清ALT、AST、TBIL 顯著升高，ALB 顯著降低，說明CCl4導致了肝功能的損傷。同時，血清中的纖維化因子HA 和LN 含量均顯著升高，表明模型組小鼠組織中出現了纖維化改變。肝組織病理變化如圖1，空白組可見正常的肝組織結構，肝細胞排列整齊規則。模型組肝細胞高或中度濁腫變性，形成大小不等橢圓形肝細胞結締組織構成假小葉，結節周圍纖維組織沉積增生，顯示出明顯的纖維化特征，表明造模成功。

圖1 HE 染色顯示肝組織炎癥情況（100×）Fig 1 HE stain for liver tissue inflammation（100×）

表1 EFT 對肝纖維化小鼠血清ALT，AST，ALB，TBIL，HA 及LN 的影響(Mean±SEM)Tab 1 Effect of EFT on serum ALT，AST，ALB，TBIL，HA and LN levels (Mean±SEM)

與模型組相比，陽性對照組血清中的肝功能和纖維化因子指標均明顯改善；同時，肝臟病變減輕，肝小葉結構基本完整，僅有少量肝細胞輕度濁腫，纖維間隔變窄，脂肪空泡的形成明顯降低。與模型組相比，EFT 組血清中的肝功能和纖維化因子指標均明顯改善；從病理切片結果可知，與陽性對照組類似，經過EFT 干預后，小鼠肝臟的病變減輕，肝小葉結構基本保持完整，纖維間隔明顯減少，脂肪空泡也有一定程度減少，這表明EFT 對CCl4所誘導的小鼠肝纖維化模型有良好的干預作用。

3.2 EFT 靶點和肝纖維化相關靶點的預測

福建野鴉椿果中的21 個三萜類化學成分如表2所示，共得到140 個化合物作用靶點，肝纖維化疾病相關靶點96 個。將以上獲得的靶點用來構建“成分-靶點-疾病”網絡[23]。

表2 EFT 編號與化合物名稱對照表Tab 2 Number and compound name of EFT

3.3 EFT 活性成分-作用靶點網絡構建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件構建福建野鴉椿果三萜類成分-作用靶點網絡圖，如圖2所示，共有161 個節點，1413 條邊，其中黃色代表活性成分，綠色代表作用靶點[24]。從圖中可以明顯看出：每個EFT 成分均可作用于多個靶點，每個作用靶點同時與多個活性成分相關；從而體現出EFT 類活性成分在發揮治療作用的網絡關系特點，并且不同成分可通過相同靶點加強治療作用[25]。

圖2 EFT 活性成分-作用靶點網絡圖Fig 2 “Compound-target” network diagram of EFT

3.4 EFT 活性成分-靶點-肝纖維化網絡構建

通過計算每個蛋白的拓撲性質尋找福建野鴉椿果治療肝纖維化作用的關鍵靶點，最后獲得33個主要節點，繪制其互作圖[26]。圖3中黃色代表EFT 類有效成分，綠色代表藥物靶點，藍色代表疾病靶點，紅色代表共同靶點，連線表示靶點之間的相關性[16，21，25]。

圖3 EFT 抗肝纖維化的成分-靶點-疾病交互網絡Fig 3 “Compound-target-disease” network diagram of EFT against liver fibrosis

3.5 生物過程與通路分析

從生物過程（biological progress，BP）分析中可以看出與靶點相關的生物過程（見圖4），涉及DNA 模板轉錄、RNA 聚合酶Ⅱ對轉錄的正調節作用、細胞對缺氧的反應、葡萄糖穩態、凋亡過程負調控、細胞對過氧化氫的反應、I-κB 激酶/NF-κB 信號轉導的負調控、內皮細胞增殖的正調控、Smad 蛋白信號轉導、炎癥反應負調節等生物過程。

從分子功能（molecular function，MF）分析中可以看出與靶點相關的分子功能，靶點具備能和DNA 結合轉錄激活劑，RNA 聚合酶Ⅱ特異性、類固醇激素受體活性、RNA 聚合酶Ⅱ順式調控區序列特異性DNA 結合、鋅離子結合、DNA結合轉錄因子活性、核心啟動子序列特異性DNA結合、染色質結合、甾體結合、序列特異性DNA結合、核受體活性等結合的分子功能。

從細胞成分（cellular component，CC）分析中可以看出與靶點相關的細胞成分，靶點主要分布于細胞中核染色質、核常染色質、細胞核、細胞器膜等部位[20，23-24]。

通過對福建野鴉椿果治療肝纖維化的33 個關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，得到8 條主要的生物信號通路，按P值由小到大排序的前列，選取與肝纖維化相關的6 條通路：叉頭轉錄因子信號通路（FoxO signaling pathway）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、胰島素抵抗（insulin resistance）、血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）、沙門氏菌感染（Salmonellainfection）（見圖5）。

4 討論

4.1 EFT 對小鼠肝纖維化的干預作用

在前期工作中本課題組用福建野鴉椿果水提物和EFT 做了小鼠的急性毒性實驗，發現在小鼠最大耐受量下，各器官實質均無明顯損傷。為了將藥物的治療效果最大化，我們提高灌胃量進行給藥，開展后續實驗。本實驗在建立CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型后，通過觀察HE 染色后的病理切片，發現EFT 能夠明顯抑制CCl4所造成的肝損傷和纖維化病變。血清ALT、AST、ALB 和TBIL的含量是臨床評估肝功能常用的指標。在本次實驗中，EFT 的干預對這些指標變化的逆轉作用顯著。HA、LN 是肝臟纖維組織主要基質成分，其血清中的含量可反映肝纖維化嚴重程度，EFT 的干預同樣能夠降低其含量。綜上，本研究明確了EFT 對CCl4所誘導的小鼠肝纖維化的干預作用。

4.2 網絡藥理學預測構建EFT 活性成分-靶點-肝纖維化網絡

采用網絡藥理學的方法對EFT 作用肝纖維化的機制進行預測，野鴉椿屬植物在化學成分上有著高度的一致性[4]，故本研究篩選出了野鴉椿屬植物中共21 個三萜成分，構建了福建野鴉椿果“三萜活性成分-作用靶點”網絡圖，共獲得140個靶點。福建野鴉椿果“活性成分-靶點-肝纖維化”靶點互作圖分析得到33 個關鍵靶點，在一定程度上反映出它們之間存在復雜交錯的相互關系，并非獨自發揮作用。GO 分析結果表明，福建野鴉椿果治療肝纖維化涉及細胞過程和代謝過程等生物過程，涉及核染色質、核常染色質、細胞核、細胞器膜等細胞組分，有酶、受體、蛋白質等多種物質的參與，是一個復雜的網絡。從KEGG 通路分析中可以看出，福建野鴉椿果治療肝纖維化涉及多條復雜的信號通路。

福建野鴉椿果21 種活性成分中熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、坡模酸、常春藤皂苷元連接較多靶點數。這些成分所連接的140 個靶點中，PGR、HMGCR、CYP19A1、NR3C1、AR、PPARA、PPARG、PTGS2、MAPK3、TNF、IL-6 等度值較大，是福建野鴉椿果治療肝纖維化的主要作用靶點。其中TNF 和IL-6 度值顯著，更因其炎癥因子的身份而頗受關注。TNF 和IL-6 是主要由巨噬細胞主要分泌的一類促炎因子，其產生能夠促進巨噬細胞進一步向促炎型轉化，損傷肝實質細胞，激活肝星狀細胞，促進肝纖維化發展[2]。福建野鴉椿果中的熊果酸和齊墩果酸具有抗氧化作用，可通過提高肝損傷后的多種抗氧化酶活性，降低TNF-α、IL-6 等炎性因子水平，阻滯肝纖維化形成[8-11]。鄧莉等[14]報道齊墩果酸能抑制TNF-α誘導的成纖維細胞樣滑膜細胞炎癥因子IL-6及IL-1β的產生。王穎等[13]發現山楂酸在CCl4誘導的炎癥性肝損傷的模型中能顯著降低肝組織中TNF-α和IL-1β表達。以上研究表明福建野鴉椿果的抗肝纖維化作用可能與其對巨噬細胞的作用有關。巨噬細胞是肝內最主要的免疫細胞，具有高度的可塑性和異質性，可針對不同的刺激信號作出應答，在不同微環境下可分化成表型和功能迥異的不同類型，釋放促炎因子或抗炎因子[27-29]。在肝纖維化啟動的早期炎性反應期，巨噬細胞在LPS、IFN-γ等誘導下，主要表現為M1 型，高表達和分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等，并高表達CD68、CD40 等表面抗原提呈分子，而抗炎細胞因子IL-10、IL-22 等的分泌量較低[2，30]。這些促炎因子可迅速作用于肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC），促進靜息狀態的HSC 增殖，并向肌原纖維母細胞或肌成纖維樣細胞轉變，合成并釋放ECM，從而啟動肝纖維化[28，31-32]。

4.3 EFT 抗肝纖維化作用的相關信號通路

KEGG 分析結果將EFT 抗肝纖維化作用的機制指向其對Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號傳遞的調控[33]。TLR 是巨噬細胞所表達多種模式識別受體之一，包括TLR2、TLR4、TLR9 等，這些受體可以對LPS 等病原體成分進行識別，并進行炎癥信號的傳遞。TLR4 是Toll樣家族中的一員，作為重要的模式識別受體，能夠識別內源性的HMGB1，促進TNF-α和IL-1β的產生，從而傳遞炎癥信號，加重肝損傷[34-35]。當TLR4 被抑制之后，下游炎癥因子理論上應該會減少。通過查閱文獻發現，EFT 中熊果酸、齊墩果酸等化合物能夠對TLR 信號通路的傳遞進行抑制[28，30]。PPAR 是TLR 信號傳遞的重要調控因子，PPARA 與PPARG 同屬于過氧化物酶體增生激活受體家族，其活化對肝纖維化具有重要的調節作用[30，36]。在生理狀態下，巨噬細胞的TLR信號由于PPAR 的負調控而無法向下游傳遞，一系列炎癥基因的表達處于抑制狀態[30，37-38]。但在肝損傷過程中PPAR 會出現表達量減少和功能異常，這被認為與肝臟炎癥介質的釋放和纖維化的進展有關[39]。張揚武等[15]發現熊果酸能夠抑制HSC-T6 細胞增殖，降低ECM 分泌，該機制可能與上調PPAR-γ表達有關。

脂肪酸結合蛋白（fatty acid-binding protein，FABP1）是藥物和疾病共有的作用靶點，對肝細胞中脂類代謝和脂類鏈接起重要作用，其活性的改變與肝纖維化、脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發生發展過程密切相關[40]。肝型脂肪酸結合蛋白FABP1主要表達于肝臟，對肝細胞中脂類代謝和脂類鏈接起重要作用，并且FABP1 的活性改變與肝纖維化、脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發生發展過程密切相關，血液中FABP1 的濃度可預測肝損傷程度，FABP1 有望成為肝細胞損傷早期的生物標志物，當肝臟受到輕微損傷時，肝小葉中央區域的肝細胞會迅速響應，大量釋放FABP1[41-43]。

叉頭轉錄因子（forkhead box protein O，FoxO）中研究最多的是FoxO1 和FoxO3，它們廣泛參與了肝纖維化病變的各個階段[36]。研究表明，FoxO1和FoxO3 可通過誘導HSC 中p27基因的表達，使HSC 的細胞周期阻滯，抑制HSC 增殖[44-45]。此外，這兩個蛋白能夠抑制抗凋亡因子IL-1β-轉換酶抑制蛋白（cellular homolog FLICE-like inhibitory protein，c-flip）的表達，激活caspase-8 和caspase-3，導致活化的HSC 凋亡[45-46]。機體中血管內皮生長因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在正常情況下水平很低，只是維持正常的血管密度和通透性[47]。當肝纖維化發生時，局部病變組織出現缺氧，HSC 活化，引起VEGF 水平升高，VEGF 的轉錄激活最終會誘導血管生成[36，48]。Jaroszewicz 等[49]提出，VEGF 血清和受體水平反映了肝功能損害的程度。

本實驗明確了EFT 成分的抗肝纖維化活性，并通過網絡藥理學的方法預測了福建野鴉椿果發揮抗肝纖維化作用可能的作用靶點及通路。將動物實驗與網絡藥理學相結合，初步揭示了福建野鴉椿果治療肝纖維化的作用機制，為其抗肝纖維化機制的闡明奠定基礎，同時也為其他網絡藥理學工作的開展提供借鑒。