褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3細胞增殖抑制及凋亡作用的相關機制研究

朱雯婷，陳亦清，劉曉敏，洪曄，袁中文，劉圣曜（.廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣州5050；2.廣州醫科大學附屬第二醫院骨科，廣州 50260）

卵巢癌是一種高死亡率的婦科腫瘤，嚴重威脅婦女的健康。目前卵巢癌的一線化療藥物主要有紫杉醇（paclitaxel，PTX）和順鉑，這些藥物具有較好的抗腫瘤活性，但是對正常組織有一定的毒副作用，且易產生耐藥[1]。因此，聯合其他藥物治療卵巢癌可能是一種新的有效手段。

褪黑素（melatonin，Mel）是一種主要由松果體產生的激素，可用于治療多種疾病，包括神經退行性疾病、癌癥、病毒感染等[2-3]。褪黑素對于乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌、宮頸癌等具有細胞毒作用，特別是對激素依賴性腫瘤具有重要作用[4-5]。可能與其作用多種信號通路相關，例如Akt/mTOR 通路，增加活性氧的產生，線粒體或內質網應激效應等[6-7]。新的研究表明，褪黑素聯合化療藥物可以增強藥物抗腫瘤效果[8]。但褪黑素是否能增強紫杉醇對卵巢癌的化療效果至今未見報道。因此，探討褪黑素聯合紫杉醇體內外治療卵巢癌的作用有重要的臨床意義。

1 材料

褪黑素（純度＞95%，MB1475）、紫杉醇（MB1178）（大連美侖生物技術公司）。Bax 抗體（50599-2-lg）、Bcl-2（12789-1-AP）兔抗人單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），Ki-67 兔抗人單克隆抗體（ab16667，Abcam 公司）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗人單克隆抗體（AB-P-R001，杭州賢致生物），辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG（CW0103，康為世紀公司），細胞凋亡檢測試劑盒（C1062M）、Hoechst 33258 染色液（C1017）、BCA 試劑盒（P0012S）（上海碧云天生物科技有限公司）。

人卵巢癌細胞株SKOV3 細胞（廣州醫科大學附屬第三醫院）用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。6 ～8周雌性BALB/c 裸鼠20 只，體質量18 ～20 g[珠海百試通生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（粵）2020-0051]。

倒置熒光顯微鏡（TE2000-S）、正置熒光顯微鏡（Ni-u）（日本尼康公司），活細胞顯微激光掃描成像系統（A1，日本尼康公司），凝膠成像系統（Bio-Rad Model 680），流式細胞儀（Thermo Fisher，Life Science）。

2 方法

2.1 細胞增殖和形態觀察

用不同濃度的紫杉醇或褪黑素聯合紫杉醇作用于SKOV3 細胞，處理48 h 后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態，并通過噻唑藍（MTT）法檢測細胞存活率，在490 nm 波長處測定吸光度值。

通過細胞克隆實驗檢測褪黑素聯合紫杉醇對SKOV3 細胞增殖的影響，SKOV3 細胞接種于6 孔板中，密度為1×103個/孔。實驗分成4 組，分別為空白組，褪黑素（200 μg·mL－1）組，紫杉醇（20 μg·mL－1）組，褪黑素（200 μg·mL－1）聯合紫杉醇（20 μg·mL－1）處理組，每孔藥液量為2 mL。7 d 后，用結晶紫對形成的集落進行染色并定量。

2.2 細胞凋亡檢測

用流式細胞儀和Hochest 33258 染色檢測藥物對SKOV3 細胞凋亡的影響。將1×104個/孔SKOV3 細胞接種于6 孔板中（Hochest 33258 染色實驗取潔凈蓋玻片置于6 孔板），分別用單獨的褪黑素（200 μg·mL－1）、紫杉醇（20 μg·mL－1）或兩藥聯合處理48 h。

流式檢測細胞凋亡實驗參考細胞凋亡檢測試劑盒進行如下操作：48 h 后將細胞消化并離心收集，用PBS 洗滌細胞兩遍，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻，室溫孵育20 min 后，上機進行檢測。

Hoechst 33258 染色實驗進行如下操作：在6孔板中加入0.5 mL 的固定液固定10 min，用PBS洗3 遍，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液染色5 min，再用PBS 洗3 遍，每次3 min，在載玻片上滴一滴抗熒光淬滅封片液，蓋上貼有細胞的蓋玻片，用活細胞顯微激光掃描成像系統進行觀察。

2.3 蛋白質印跡分析

藥物處理后的SKOV3 細胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解30 min 提取蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。上樣后用SDS-PAGE 膠分離、轉膜。使用5%的牛奶進行封閉，用不同一抗4℃孵育過夜（GAPDH，稀釋比例1∶2000，Bax 稀釋比例1∶1000，Bcl-2 稀釋比例1∶1000），TBST洗滌3 次，然后在室溫下孵育HRP 標記山羊抗兔IgG 的二抗（稀釋比例1∶5000），最后在PVDF 膜上滴加Ecl 發光液（Millipore，USA）用凝膠成像系統進行顯影。

2.4 體內抗腫瘤作用

在BALB/c 裸鼠右背部皮下注射100 μL SKOV3 細胞懸液（5×106個）和100 μL 基質膠混合液。約10 d 后，當腫瘤體積大于100 mm3時，將裸鼠隨機分為4 組，分別接受生理鹽水，褪黑素（25 mg·kg－1），紫杉醇（20 mg·kg－1），褪黑素與紫杉醇聯合腹腔注射給藥。每兩日給藥一次，并測量腫瘤的體積，腫瘤體積的計算公式＝長×寬2/2，給藥6 次后，處死裸鼠收集腫瘤組織稱重，并拍照。

將石蠟包埋的腫瘤切片脫蠟至水，蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察腫瘤組織形態和結構。染色后，在正置熒光顯微鏡隨機取不同的視野拍照。

2.5 免疫組化

腫瘤切片脫蠟至水，用pH 6.0 的檸檬酸緩沖液在90℃熱修復30 min，冷卻至室溫，參考兔/鼠通用型Streptavidin-HRP 試劑盒（CW2069，康為世紀）說明書步驟如下：切片用內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育10 min，PBS 充分洗滌，羊血清室溫孵育10 min，甩干后用一抗（Ki-67 稀釋比例1∶200）4℃下孵育過夜，PBS 洗3 遍，每次3 min。然后在室溫下與生物素標記羊抗兔/鼠二抗工作液孵育10 min，再滴加適量HRP 標記的鏈霉親和素，室溫孵育10 min，最后，加適量的二氨基聯苯胺（Dia minobenzidine，DAB）顯色工作液染色3 min。脫水透明封片在正置熒光顯微鏡，隨機取3 個視野進行拍照。

2.6 TUNEL 熒光法染色

腫瘤石蠟切片脫蠟至水。參考原位末端轉移酶標記技術（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）一步法細胞凋亡檢測試劑盒（KGA7071，凱基生物）說明書步驟如下：用Proteinase K 工作液在37℃反應30 min，PBS 漂洗3 次。放入濕盒中，每張切片滴加配制好的TdT 酶反應液，37℃處理45 min，再用PBS 漂洗3 次。每個樣本上滴加 50 μL Streptavidin-FITC 標記液，37℃避光反應 30 min，最后用含DAPI 染色液的抗熒光淬滅封片，在活細胞顯微激光掃描成像系統觀察細胞凋亡。

2.7 統計分析

使用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。數據采用平均值±標準差表示。對各組數據進行方差齊性檢驗，方差齊，多組均數間比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 褪黑素聯合紫杉醇對SKOV3 細胞的增殖的抑制作用

褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細胞的毒性結果，如圖1A 所示，用200 μg·mL－1的褪黑素處理SKOV3 細胞48 h，細胞形態正常，而褪黑素與20 μg·mL－1紫杉醇聯合處理48 h 后，細胞形態發生變化，且細胞數量顯著減少。紫杉醇對細胞的毒性具有濃度依賴性，通過SPSS 軟件非線性回歸擬合計算得出，紫杉醇作用48 h 的IC50為28 μg·mL－1，而用200 μg·mL－1褪黑素聯合不同濃度的紫杉醇會增加對SKOV3 細胞的細胞毒性，IC50降為13.46 μg·mL－1，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖1C）。

細胞克隆實驗驗證褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌細胞增殖的影響，結果如圖1B 所示。與紫杉醇單藥處理組相比，褪黑素聯合紫杉醇處理組能明顯減少人卵巢癌細胞SKOV3 的克隆集落數，計算每組克隆集落數，如圖1D 所示，褪黑素聯合紫杉醇組克隆集落數顯著低于褪黑素單藥組（P＜0.001），紫杉醇單藥組（P＜0.05），說明兩藥聯合能更好地抑制SKOV3 細胞增殖。

圖1 褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細胞增殖的影響Fig 1 Effect of melatonin combined with paclitaxel on proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells

3.2 褪黑素聯合紫杉醇誘導卵巢癌SKOV3 細胞凋亡作用

褪黑素和紫杉醇對SKOV3 細胞凋亡的影響結果見圖2。圖2A 顯示空白未處理組的凋亡率僅為（3.19±0.43）%，褪黑素處理48 h 后，凋亡率為（5.36±0.90）%，紫杉醇組的凋亡率為（14.99±1.41）%，褪黑素和紫杉醇聯合使用時的細胞凋亡率約為（26.5±2.12）%，與單藥物組相比差異有統計學意義（見圖2C，P＜0.01，P＜0.001）。此外，Hoechst 33258 染色結果顯示，在兩藥聯合藥物處理組中，細胞核出現明顯的固縮，或呈碎塊狀，說明兩藥聯合能明顯增加細胞的凋亡。Bax 和Bcl-2是凋亡途徑中的重要蛋白，如圖2D 所示，褪黑素和紫杉醇聯合處理組中Bcl-2/Bax 的比例與空白組和單藥處理組相比明顯更低。

圖2 褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of melatonin combined with paclitaxel on apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells

3.3 褪黑素聯合紫杉醇對移植瘤的抑制作用

SKOV3 移植瘤裸鼠模型觀察褪黑素聯合紫杉醇的體內抗腫瘤作用。圖3A 腫瘤的生長曲線的結果顯示，兩藥聯合組的腫瘤生長緩慢，顯示出較強的抗腫瘤效果。與單藥組相比，差異有統計學意義。圖3B 是給藥結束后每組取出的腫瘤組織的代表圖，紫杉醇組的腫瘤體積小于生理鹽水組，而兩藥聯合組的體積明顯小于紫杉醇組。將各組的腫瘤組織取出來進行稱重，瘤重結果如圖3C 所示，褪黑素聯合紫杉醇組的質量小于褪黑素組單藥組[（0.148±0.02 g）vs（0.717±0.06）g，P＜0.001]和紫杉醇單藥組[（0.148±0.02 g）vs（0.308±0.07）g，P＜0.01]。圖3D 中腫瘤組織的HE 染色結果表明，生理鹽水組中的腫瘤細胞成簇生長，并且結構緊湊且正常，褪黑素和紫杉醇單藥組顯示局部缺血和缺氧壞死，而聯合治療組的缺血性壞死部分更大。

圖3 褪黑素聯合紫杉醇在SKOV3 移植瘤模型中的抗腫瘤作用Fig 3 Anti tumor effect of melatonin combined with paclitaxel on SKOV3 xenograft tumor model

3.4 褪黑素聯合紫杉醇對移植瘤Ki-67 與瘤組織細胞凋亡的影響

藥物對荷瘤裸鼠腫瘤細胞增殖情況的影響如圖4A 所示。生理鹽水組腫瘤組織Ki-67 的表達水平最高（81.6±6.8）%，紫杉醇治療組Ki-67 表達下降，而褪黑素聯合紫杉醇組Ki67 陽性細胞數（20.3±4.5）%明顯低于褪黑素單藥組（60.3±7.1）%（P＜0.001）和紫杉醇單藥處理組（31.0±2.6）%（P＜0.05）（見圖4B），表明兩藥聯合對細胞增殖的抑制作用強于單藥治療組。

圖4 Ki-67 染色檢測褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 移植瘤模型細胞增殖的影響（40×）Fig 4 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by Ki-67 staining（40×）

TUNEL 染色檢測藥物作用后對裸鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響。如圖5所示，生理鹽水組和褪黑素組幾乎沒有綠色熒光點的存在，而紫杉醇組和褪黑素聯合紫杉醇治療組綠色熒光明顯增多，且兩藥聯合組的熒光明顯強于紫杉醇單藥治療組，表明褪黑素的加入可以明顯增強紫杉醇引起的細胞凋亡。

圖5 TUNEL 染色檢測褪黑素聯合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 移植瘤模型細胞凋亡的影響（20×）Fig 5 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by TUNEL staining（20×）

4 討論

褪黑素在多種癌癥具有顯著的抑制作用。褪黑素可抑制腫瘤有氧糖酵解、細胞增殖、轉移相關的細胞信號通路，并克服了腫瘤的多藥耐藥[9-11]。例如，褪黑素可通過降低組蛋白脫乙酰基酶9 的表達來抑制非小細胞肺癌的生長并促進細胞凋亡[12]；通過下調ZNF746 調節的MMP-9/MMP-2 通路來抑制膀胱癌的增殖、遷移和侵襲[13]。

實驗表明在聯合給藥組中SKOV3 卵巢癌細胞的增殖被顯著抑制，Ki-67 的陽性率低于單藥組。因此，可以推斷兩種藥物的聯合可以起到抑制腫瘤增殖的協同作用。此外，聯合給藥可顯著誘導卵巢癌SKOV3 細胞凋亡。Bcl-2 是一種膜蛋白，主要位于線粒體的外膜上，誘導caspase-3/-9的釋放。該家族中的蛋白表現出促凋亡或抗凋亡活性，其中Bcl-2/Bax 比值可作為確定細胞凋亡易感性的標志物[14]。本研究發現褪黑素聯合紫杉醇通過在體外下調Bcl-2/Bax 比值來誘導卵巢癌細胞凋亡。體內TUNEL 染色結果進一步說明褪黑素增強了紫杉醇對卵巢癌細胞的促凋亡作用。

研究發現，褪黑素和化療藥物的聯合不僅能極大地增強藥物對腫瘤細胞的療效，而且可以降低化療的副作用[15]。例如，化學療法引起的神經性疼痛是癌癥治療中常見的毒副作用，褪黑素作為一種有效抗氧化劑可通過降低氧化應激，減少由化療藥物紫杉醇引起的線粒體損傷和神經性疼痛[16]。綜上所述，褪黑素一種安全有效的化療增敏劑，與紫杉醇的聯合療法具有良好的臨床應用前景。