陰溝腸桿菌乳酸脫氫酶基因缺失突變株的構建及其生物學特性

石會玲，周宇航，何 平，黃蒙蒙，邵 帥，葛菁萍，凌宏志

（1黑龍江大學生命科學學院微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500）

0 引言

乙偶姻(AC)又稱3-羥基丁酮或甲基乙酰甲醇[1]，具有特殊的奶油香味，自然存在于干酪、香蕉、可可、玉米、葡萄、蘋果和肉類等食品中[2-3]，乙偶姻的應用范圍極其廣泛，為滿足社會的需求，目前有大量的學者對于乙偶姻的生產方法及產量進行研究[4-5]。微生物以糖類物質為底物發酵生產乙偶姻是比較典型的發酵途徑，葡萄糖通過磷酸轉移酶系統(PTS)被細胞利用，其中除部分碳源供菌體生長以外，還會形成一系列的中間代謝產物和副產物，如乳酸、乙酸、丁二酸、乙醇、2,3-丁二醇和乙偶姻等[6-7]。在發酵過程中，這些副產物的產生不僅消耗了代謝過程中產生的能量，而且對乙偶姻的產量積累產生不利的影響，增加了下游工程中乙偶姻分離純化的難度[8-11]。因此，對乙偶姻代謝支路副產物的相關關鍵酶基因敲除成為基因工程改造提高乙偶姻產量的主要策略之一[12-16]。

自殺質粒同源重組技術是將構建好的自殺敲除質粒，通過細菌接合的方法進入到受體菌中[17]。將擴增的外源的目的基因同源重組片段插入到自殺質粒當中，利用自殺質粒可以在供體菌中復制，但不可以在受體菌中復制特點，通過細菌接合的方式使自殺質粒進入到受體菌中[18]。在重組酶的作用下，使自殺質粒上的線性打靶片段與染色體的特定目的基因序列發生同源重組，目的基因被置換下來，然后利用自殺質粒上的抗生素篩選標記篩選單交換陽性轉化子[19-20]。接合同源重組作為一種基因敲除手段，由于接合的方法對于分子量大的質粒的轉化具有很好的效果、適用范圍廣及敲除效率高等特點在原核生物的菌種改造方面有著極為廣泛的應用[21]。

本研究以實驗室保藏的陰溝腸桿菌(E.cloacae)作為出發菌株，對該菌種進行乳酸脫氫酶ldh基因進行敲除，對原始菌株進行基因改造，構建敲除ldh基因的陰溝腸桿菌(E.cloacae△ldh)并對其生物特性進行初步研究。通過本課題的研究，利用接合同源重組技術生產乙偶姻，為構建高效、穩定的生產乙偶姻工程的菌株奠定了良好的技術基礎。同時采用了同源重組技術，這也為利用分子手段進行菌株改造探索了方法，為今后相關微生物發酵工程菌株的獲得及大規模工業生產提供技術支持和菌種保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 陰溝腸桿菌E.cloacae，大腸桿菌E.coli DH5α以及大腸桿菌E.coli S17-1 λpir均來自于黑龍江大學微生物重點實驗室，用于ldh左右同源臂的克隆轉化和與E.cloacae接合。

1.1.2 實驗質粒 pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司，用于克隆載體；自殺質粒pKR6K由黑龍江大學微生物重點實驗室保存；質粒pT-ldh和pKR6K-△L均自行構建，用于克隆ldh上下游片段和敲除ldh基因自殺質粒。

1.1.3 酶與試劑 1.1×T3 Super PCR Mix(TSE030)購自北京擎科新業生物技術有限公司，TranStart?FastPfu DNA polymerase(AP221-01)、2.5 mmol/L High Pure dNTPs(AD101-1)購自北京全式金生物技術有限公司，限制性核酸內切酶BamHI(R0136V)、EcoRI-HF(R3101V)、XbaI(R0145V)、SphI(R0182V)、SalI-HF(R3138V)、HindIII-HF(R3104V)均購自 New England Biolabs公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、質粒小提試劑盒（貨號DP103-02）及細菌基因組DNA（小量）提取試劑盒(DP302-02)均購自北京天根生化科技有限公司。Taq DNA polymerase、DNA Ligation Kit Ver.2.1(6022Q)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、DL2000 Marker(3427A)、DL5000 Marker(3582Q)、DL15000 Marker(3582A)購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 擴增引物 根據NCBI數據庫中E.cloacae的基因組序列信息，利用Snapgene設計實驗所用的PCR引物，用于克隆ldh基因以及驗證敲除結果，如表1所示。

表1 引物序列

1.1.5 培養基 LB(Luria-Bertani)培養基(g/L)：NaCl 10，酵母提取物 5，蛋白胨 10，pH 7.0，121℃高壓滅菌15 min，固體培養基添加2%的瓊脂粉，用于本研究細菌的培養。

種子培養基(g/L)：K2HPO44.4，KH2PO41.3，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，酵母浸粉1，加入蒸餾水定容至1 L，調節pH 7.0，121℃高溫高壓滅菌15 min。將上述已滅菌的溶液加入到經108℃高壓滅菌20 min的40 g葡萄糖中，用于陰溝腸桿菌的培養；加入到經108℃高壓滅菌20 min的60 g葡萄糖中，用于陰溝腸桿菌生產乙偶姻的發酵實驗。

1.2 方法

1.2.1 出發菌株E.cloacae基因提取 將經過菌株活化和復壯后的E.cloacae接種到LB液體培養基中，35℃，140 r/min的條件下培養至對數期，利用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取2株菌體的基因組。

1.2.2ldh基因上下游片段的克隆與測序 用表1的引物對ldh基因上下游片段進行PCR擴增，PCR反應體系和反應程序如表2和表3所示。以pMD18-T載體為連接骨架，分別將加“A”后的ldh1基因和ldh2基因PCR產物與其在16℃金屬浴中過夜連接，進行“TA”克隆，將重組質粒命名為pT-ldh1和pT-ldh2。

表2 ldh1和ldh2 PCR反應體系組分

表3 ldh1和ldh2 PCR反應程序

1.2.3 pKR6K-△L敲除質粒的構建 利用內切酶EcoRI和BamHI對pT-ldh1和自殺質粒pKR6K分別進行雙酶切，在37℃條件下反應120 min，將回收片段ldh1通過T4連接酶插入到線性載體pKR6K(EcoRI、BamHI)中，16℃過夜連接。在插入ldh1片段的相鄰位置，選擇內切酶XbaI和SalI分別對pT-ldh2和插入到線性載體pKR6K-ldh1(XbaI、SalI)過程中進行酶切處理，這樣ldh1-ldh2部分就組成了敲除ldh基因的同源重組片段，同時得到ldh基因敲除質粒pKR6K-△L。整體構建策略如圖1所示。

圖1 基因敲除質粒pKR6K-△L完整構建策略

1.2.4E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株的生長情況的測定 出發菌株E.cloacae和重組菌株E.cloacae△ldh以1%接種量分別接種到100 mL/250 mL種子液培養基中35℃，140 r/min培養至對數生長期，以1%接種量分別轉接到100 mL/250 mL發酵培養基中，35℃，140 r/min發酵48 h后結束。分別在0、2、4、8、12、24、36、48 h取樣，將樣品稀釋10倍進行其pH和OD600處的吸光值的測定。繪制菌株生長情況及發酵液的pH的變化曲線。

1.2.5E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株的發酵產物及底物消耗情況檢測試驗 將E.cloacae和E.cloacae△ldh甘油管接種到種子培養基中擴大培養(35℃，140 r/min)，在12 h后，以1%的接種量將種子培養基中的菌液接種到發酵培養基中，發酵48 h。溫度35℃，轉速140 r/min。分別在0、2、4、8、12、24、36、48 h取樣。樣品經處理后，經高效液相色譜(HPLC)檢測乙偶姻等相關代謝產物的產量以及底物的剩余濃度。

1.2.6 試驗數據的統計學分析 運用SPSS Statistics19軟件對本試驗所有樣本重復的試驗數據進行統計學分析，試驗數據均以X±SD表示，均數間的比較采用差異顯著性分析，ldh0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 E.cloacae基因組提取

原始菌株E.cloacae進行基因組提取，對提取的樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，在15 kb的上方有一條清晰的條帶，說明E.cloacae基因組提取成功。

圖2 E.cloacae基因組DNA

2.2 ldh基因上下游片段的克隆及測序

以上述提取的原始菌株E.cloacae基因組DNA為模板，利用引物ldh1F、ldh1R和ldh2F、ldh2R分別對目的基因ldh1和ldh2進行PCR擴增，擴增產物大小均為526 bp（圖3），與預期結果一致。

圖3 ldh1和ldh2片段擴增結果

將擴增產物分別與克隆載體pMD18-T連接，通過熱激法轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，提取菌株質粒分別進行HindIII單酶切驗證，以1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在2500 bp和5000 bp中間有一清晰的條帶，長度大小與擴增產物ldh1、ldh2(506 bp)和pMD18-T(2692 bp)之和(3218 bp)相符，證明目的基因ldh1、ldh2已連接到克隆載體（圖4）。

圖4 HindIII酶切結果

2.3 pKR6K-△L敲除質粒的構建

以限制性內切酶EcoRI和BamHI對質粒pT-ldh1和pKR6K進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，酶切結果如圖5所示，質粒pT-ldh1和pKR6K被完全酶切。通過T4連接酶連接pKR6K（EcoRI和BamHI，5199 bp）與ldh1（EcoRI和BamHI，506 bp），連接產物通過熱激法轉化到E.coliS17-1感受態細胞中。

圖5 EcoRI和BamHI酶切結果

提取質粒pT-ldh2和pKR6K-ldh1，以限制性內切酶XbaI和SalI對上述質粒進行雙酶切，pT-ldh2酶切結果如圖6所示，質粒pT-ldh2和pKR6K-ldh1被完全酶切。通過T4連接酶連接pKR6K-ldh1（XbaI和SalI，5699 bp）與ldh2（XbaI和SalI，506 bp），連接產物通過熱激法轉化到E.coliS17-1感受態細胞中。

圖6 XbaI和SalI酶切結果

2.4 E.cloacae乳酸脫氫酶(ldh)基因缺失菌株的篩選

E.cloacae中ldh基因單交換菌株的篩選結果如圖7所示，將發生單交換重組的E.cloacae接種于含10%蔗糖不含NaCl的LB培養基中35℃過夜培養后，涂布于含10%蔗糖不含NaCl的LB固體培養基上，35℃過夜培養，對長出的菌落進行菌落PCR驗證，利用發生重組部分的外側引物ldh-up和ldh-down進行PCR反應，如圖8所示，同源重組片段ldh1-ldh2已完全整合到宿主菌E.cloacae的染色體基因組上。

圖7 E.cloacae中ldh基因單交換菌株的篩選

圖8 E.cloacae△ldh突變株篩選結果

2.5 E.cloacae與E.cloacae△ldh的生長情況

對E.cloacae和E.cloacae△ldh進行搖瓶發酵試驗（E.cloacae作為對照菌株），結果如圖9所示。敲除ldh基因對E.cloacae的生長情況并無明顯影響，二者均在12 h時達到最大值，OD600值在0.85左右。兩者的pH值變化均處于下降趨勢，穩定在5.6左右。

圖9 E.cloacae與E.cloacae△ldh的生長情況

2.6 E.cloacae與E.cloacae△ldh的發酵產物及底物消耗情況測定

通過HPLC測定乙偶姻、2,3-丁二醇、底物葡萄糖以及乳酸濃度，結果如圖10所示。由發酵結果顯示，出發菌株E.cloacae與重組菌株E.cloacae△ldh的葡萄糖均在12 h時基本耗盡，直至24 h消耗完全，菌株的OD600隨葡萄糖的消耗而增加，重組菌株在12 h時，2,3-丁二醇的產量達到最大值為18.28±0.42 g/L，此時出發菌株的2,3-丁二醇產量為17.11±0.51 g/L，由此可知敲除ldh基因使2,3-丁二醇的產量提高了6.8%，差異顯著(ldh0.05)。在原始菌株中12 h時，乳酸產量達到最大值為2.85±0.21 g/L；重組菌株E.cloacae△ldh在24 h時丁二酸的產量最高為2.46±0.10 g/L，而出發菌株在48 h時丁二酸的產量最大，為2.08±0.24 g/L，因此丁二酸的產量提高了18.3%，差異顯著(ldh0.05)。

圖10 E.cloacae與E.cloacae△ldh的發酵產物及底物消耗情況結果

出發菌株E.cloacae與重組菌株E.cloacae△ldh各產物產量如表4所示。出發菌株E.cloacae在12 h時，乳酸產量最大，為2.85±0.21 g/L；E.cloacae△ldh發酵過程中2,3-丁二醇的最大產量為18.28±42 g/L，比E.cloacae產生的17.11±0.51 g/L提高了6.8%，但乙偶姻的產量變化不大，差異不顯著(P＞0.05)。此外，丁二酸的產量由原來的2.08±0.24 g/L提高到2.46±0.10 g/L，提高了18.3%，差異顯著(ldh0.05)。乙酸產量由2.92±0.20 g/L提高到3.63±0.29 g/L，提高了24.3%，差異顯著(ldh0.05)。乙醇的產量變化不大，差異不顯著(P＞0.05)。

表4 E.cloacae和E.cloacae△ldh的搖瓶發酵產物的比較

3 討論

隨著20世紀80年代提出可持續發展概念以來，人們對于環境與資源的保護意識的日益提高，乙偶姻作為一種重要的平臺化合物，其在各個領域均被廣泛應用[22]。在自然界中，許多微生物的代謝產物中都發現了乙偶姻的存在。提高乙偶姻的產量可以從以下幾個方面進行研究，阻止乙偶姻的進一步代謝，阻斷其他分支代謝路徑以及加強乙偶姻合成的關鍵酶基因的表達[23]。Zhang等[24]敲除陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM53中2,3-丁二醇(2,3-BD)脫氫酶基因budC，運用分批補料的方法，以木質纖維素水解產物最為底物，乙偶姻產量可達45.6 g/L，乙偶姻產量得到明顯提高。Hillman等[25]發現在以葡萄糖為碳源發酵時，野生型變形鏈球菌(Streptococcus mutans)與乳酸脫氫酶缺陷型突變體相比，乳酸脫氫酶缺陷型突變體的乙偶姻產量遠高于野生型。Liu等[26]通過敲除丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因adc，使得乙偶姻得率提高了37.5%。饒志明等[27]對野生型枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JNA中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf進行過表達，以150 g/L葡萄糖對重組菌株進行發酵實驗，乙偶姻產量為71.4 g/L，乙偶姻產量相比于出發菌株提高了84%，2,3-丁二醇產量為2.4 g/L，相比于出發菌株下降了86%。Xu等[28]在大腸桿菌(Escherichia coli)中過量表達源于粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)的butB與butA基因，對重組菌株通過5 L發酵罐進行分批補料發酵，D-(-)-乙偶姻的最大產量達到60.3 g/L，產率為86.3%。

本試驗以陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM作為出發菌株，使用自殺質粒pKR6K構建基因敲除載體，通過細菌接合的方式敲除載體轉化進入受體菌中進行同源重組的基因敲除，構建了乳酸合成途徑中乳酸脫氫酶缺失重組菌株E.cloacae△ldh。以60 g/L葡萄糖為底物，同時對E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株進行搖瓶發酵培養后，利用高效液相色譜(HPLC)對發酵產物進行檢測，出發菌株乙偶姻產量為2.83±0.48 g/L，發現改造后的E.cloacae△ldh的乙偶姻產量為3.05±0.27 g/L，相比于出發菌株E.cloacae△ldh乙偶姻產量無明顯變化；E.cloacae乙偶姻的轉化率(0.05±0.01 g/g)與生產強度(0.06±0.01 g/L·h)和E.cloacae△ldh乙偶姻的轉化率(0.05±0.01 g/g)與生產強度(0.06±0.01 g/L·h)相比并沒有變化。敲除ldh基因雖然沒有對乙偶姻產量造成顯著影響，但丁二酸的產量提高18.3%，2,3-丁二醇也有小幅度的提升，這說明敲除ldh基因雖然沒有使乙偶姻的產量提高，但由于阻斷了乳酸代謝途徑，也使碳源流向了其他的代謝路徑。重組菌株E.cloacae△ldh中幾乎沒有檢測到乳酸的產生，進一步說明ldh基因成功敲除，使重組菌株不產生乳酸。

4 結論

本試驗為探索敲除陰溝腸桿菌(E.cloacae)中ldh基因對乙偶姻形成路徑中含量的的影響，以實驗室保藏的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM作為出發菌株構建E.cloacae△ldh，得到結論如下：成功克隆出兩段E.cloacae乳酸脫氫酶基因的同源序列，長度分別為526 bp，通過序列比對分析，E.cloacae乳酸脫氫酶基因序列相似性為100%。通過對E.cloacae進行乳酸脫氫酶基因的敲除，成功構建一株ldh缺失重組菌株E.cloacae△ldh，乙偶姻產量雖無明顯變化，但發酵液中并沒有檢測到乳酸，同時2,3-丁二醇提高6.8%，乙酸提高了24.3%。