基于細胞色素B(Cyt b)基因對翹嘴鲌不同群體遺傳多樣性的分析

張桂寧，方弟安,，薛向平，張敏瑩，馮曉婷，楊雪軍

（1上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部長江下游漁業資源環境科學觀測實驗站，江蘇無錫 214081）

0 引言

翹嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)隸屬于鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Cultrinae)、鲌屬(Culter)，俗稱白魚、翹嘴白等，是鲌亞科中最大的一種，是太湖“三白”之一，與松江鱸(Trachidermus fasciatus)、黃河鯉(Cyprinus carpio)、松花江鮭(Siniperca chuatsi)被譽為中國四大名魚[1]。翹嘴鲌在中國分布廣泛，幾乎各個江流湖泊中都有存在。翹嘴鲌多2～3齡性成熟，生殖季節在5—7月，5月中旬為盛產期，具有溯河產卵特性，卵黏性，受精卵黏附于水生植物或砂石上發育[1]。翹嘴鲌生長迅速，耐低氧，抗病力強，適合高密度養殖，是長江三角洲地區的主要名特淡水養殖品種[2]。鑒于翹嘴鲌的重要經濟價值和生態地位，受到眾多學者的廣泛關注與研究，目前主要集中在生物學特征研究[3]、資源現狀[4]、育種[5]胚胎發育[6]、繁殖[7]、病害[8]和遺傳多樣性[9-11]等方面。

研究遺傳多樣性對生物多樣性保護和生物資源可持續利用有重要意義，由于線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有母系遺傳、進化速率快等特性，因此，常用作研究親緣物種遺傳多樣性的理想分子標記[12]。在mtDNA的13個蛋白編碼基因中，細胞色素b基因(Cytochrome b,Cyt b)的結構和功能較為清楚，堿基含量的富集反映出Cyt b基因在密碼子使用上的偏倚性[13-14]。Cyt b基因進化速率適中，包含著從種內到種間的較強進化信號，故被廣泛地用來進行物種多樣性和系統進化等方面的研究[15]。王利華等[16]探討基于CO I和Cyt b DNA條形碼鑒定6種鲌屬魚類（達氏鲌、海南鲌、尖頭鲌、蒙古鲌、擬尖頭鲌和翹嘴鲌）的可行性，通過計算其堿基含量、群體間的平均遺傳距離、種內遺傳距離和構建系統進化樹，研究顯示，線粒體CO I和Cyt b基因可以作為DNA條形碼鑒定鲌屬魚類。王偉[17]應用擴增片段長度多態性(AFLP)、內部簡單序列重復(ISSR)和DNA序列(COII和D-LOOP)分析技術，對中國不同地理的7個群體翹嘴鲌遺傳結構和多樣性進行了分析，并對各種標記的結果進行了橫向比較，研究顯示AFLP標記要略優于ISSR標記技術，兩種序列均能提供一定的遺傳信息，但D-LOOP序列進化速度更快，另外中國野生翹嘴鲌遺傳多樣性比養殖群體豐富，遺傳結構合理。黃小彧[11]針對長江水系不同江段的14個翹嘴鲌群體，應用線粒體控制區研究其遺傳多樣性，發現不同江段的翹嘴鲌群體遺傳多樣豐富度不同，表現出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性共存的現象，遺傳多樣性較低[11]。

長江是中國第一大河，對其漁業資源遺傳多樣性的研究極其重要，太湖、淀山湖和長蕩湖均是位于長江下游的湖泊，是翹嘴鲌的良好棲息場所，近幾年，這些湖泊都有不同程度的富營養化，翹嘴鲌資源有所衰退[18]。翹嘴鲌是“太湖三白”之一，在淀山湖和長蕩湖中亦為漁業資源的優勢物種。近年來，基于線粒體DNA對長江下游水域翹嘴鲌遺傳多樣性的研究較少。因此，本研究以長江、長蕩湖、太湖和淀山湖4個水域的翹嘴鲌為研究對象，通過mtDNA Cyt b基因核苷酸序列的比較分析，探討長江下游4個水域翹嘴鲌群體的遺傳多樣性、遺傳結構和群體間的進化關系，以深入了解其遺傳背景和種質資源現狀，為翹嘴鲌的野生資源保護提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2019年5—8月，使用定制絲網和流刺網分別于淀山湖(DSH)、太湖(TH)、長蕩湖(CD)和長江(CJ)水域的固定采樣位點隨機捕獲收集翹嘴鲌尾鰭樣本，浸泡于無水乙醇中保存，其中淀山湖47尾，太湖40尾，長蕩湖40尾，長江84尾，共計211尾。

1.2 DNA提取

將鰭條樣品剪取約30 mg的組織樣品于離心管中，使用試劑盒法提取DNA（海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化有限公司），并用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，符合后續擴增要求的DNA樣品置于-20℃保存備用。

1.3 PCR和DNA測序

PCR擴增Cyt b基因所需引物序列為Cytb-F:5-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3 Cytb-R:5-CTCCG ATCTCCGGATTACAAGA-3。

PCR反應體系：總體積25 μL，包括dNTP Mixture 12 μL，上、下游引物各1.25 μL(50 μmol/L)，DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：94℃預變形5 min；94℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸5 min；4℃結束。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，將條帶清晰擴增有效的PCR產物送亦欣生物科技（上海）有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.4 數據分析

采用MEGA 7.0.26軟件中的Align by clustalW軟件進行Cyt b基因原始序列的比對、剪切。用DNASP v5[19]軟件計算群體單倍型，DNASP v5軟件進行Tajima's D和Fu’s Fs的中性測試，以衡量群體是否發生了擴張。采用Arlequin 3.5軟件[20]進行遺傳多樣性、群體的分子方差分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)、遺傳距離和基因流(Nm)值的計算。在MEGA 7.0.26軟件中以Kimura雙參數法(Kimura-2-parameter)為替代模型，采用NJ法(Neighbour-joining，NJ)構建翹嘴鲌不同群體單倍型的分子聚類樹，從分支關系分析各群體之間的親緣遠近關系。

2 結果與分析

2.1 序列特征

PCR產物基因測序之后經MEGA7.0.26軟件中的Align by Clustal W進行原始序列的比對剪切，得到1088 bp的序列，與NCBI數據庫的翹嘴鲌Cyt b序列比對，數據同源性達到99%以上。MEGA7.0.26軟件分析211個個體序列的堿基組成平均含量為T(27.1%)，C(23.1%)，A(27.9%)，G(21.9%)，A+T含量為55%，G+C為45%。表1中211個個體共有46個單倍型，單倍型多樣性在(0.849±0.004)～(0.946±0.015)，4個群體中太湖群體的最高，其次是長蕩湖群體，再次是長江群體，淀山湖水域的翹嘴鲌單倍型最低。核苷酸多樣性在0.0083～0.174，整體而言核苷酸多樣性較高，其中淀山湖群體＞長蕩湖群體＞長江群體＞太湖群體。MEGA7.0.26軟件中分析得到單態突變位點46個，簡約信息點1011個，變異位點1057，變異率為97.15%，保守位點31個。DNASP軟件分析得到258個多態性位點，約占核苷酸總數的23.71%。轉換與顛換比值(si/sv)為0.7。

表1 不同群體的單倍型及遺傳多樣性參數

2.2 單倍型分布

在211個翹嘴鲌個體共有46個單倍型，其中Hap1、Hap2、Hap3、Hap4和Hap8在長江和長蕩湖群體中共享，其余41個單倍型分別在4個地理群體中獨有，占單倍型的89.13%，其中Hap5、Hap6和Hap10-Hap19在長江群體中特有，Hap20-Hap34、Hap45及Hap46在淀山湖群體中獨有，Hap7、Hap9和Hap40在長蕩湖中特有，Hap35-Hap39和Hap41-Hap44在太湖群體中獨有。

通過Network軟件繪制單倍型網絡圖，如圖1所示，每個圓代表一個單倍型，其大小與總頻率成正比，圓圈大小表示該單倍型出現的次數。每個單倍型按地理分布用不同的顏色表示，4個地理群體的單倍型構成一個網狀結構圖，只有長江群體的長蕩湖群體有共享單倍型，長江群體和淀山湖群體的單倍型散布在各個位置，其余群體的單倍型分布較均勻。圖中圓的面積代表出現次數，由圖可知，Hap2出現次數最多為54次，包含長江群體和長蕩湖群體，其次是Hap41，出現23次，屬于太湖群體。Hap14出現22次，屬于長江群體。

圖1 4個地理群體翹嘴鲌的單倍型分布網絡圖

2.3 遺傳分化分析

由MEGA7.0.26軟件中的Data-distance計算出的4個地理群體的遺傳距離如表2所示，在表中可看出種內遺傳距離的范圍是0.01～0.04，其中太湖群體的種內遺傳距離是0.01，長蕩湖群體的種內遺傳距離最大，達到0.04。4個群體的種間遺傳距離0.052～0.152，太湖群體和淀山湖群體的種間遺傳距離最遠是0.152。

表2 不同翹嘴鲌群體遺傳距離

4個地理的翹嘴鲌群體基因流和遺傳分化指數如表3和4所示，從表中顯示出兩兩群體間的遺傳分化指數范圍在0.197～0.646。基因流值的范圍為0.152～1.010，其中長江和淀山湖群體的基因流值最小為0.152，長江與長蕩湖群體的基因流值最大為1.019。

表3 不同翹嘴鲌群體基因流(Nm)及遺傳分化指數(Fst)

表4 4個翹嘴鲌地理群體間遺傳分化參數

2.4 聚類分析

應用MEGA7.0.26軟件對211個翹嘴鲌個體的Cyt b的序列進行聚類分析，得出4個翹嘴鲌群體46個單倍型的系統進化樹如圖2所示。不同地理來源的單倍型總共分成7個大分支，Hap25、Hap28、Hap31和Hap33獨自各成一支，屬于太湖群體。Hap30和Hap34組成一支，亦屬于太湖群體，Hap45獨自為一支，屬于淀山湖群體，剩余一支包含很多單倍型，其中不同地理群體的單倍型散亂分布。

圖2 4個地理群體翹嘴鲌的單倍型NJ系統發育樹

2.5 4個翹嘴鲌群體錯配分布圖

用DNASPv5軟件分析得到如圖3所示的錯配分布圖，由圖3可知，當把4個水域的翹嘴鲌群體作為一個整體分析時，其歧點分布圖大體呈現為單峰。

圖3 錯配分布曲線

3 討論

3.1 序列組成特點

本研究中211個個體序列的堿基組成平均含量為T(27.1%)，C(23.1%)，A(27.9%)和 G(21.9%)，A+T 的含量占55%，G+C占45%，表現出A+T的含量高于G+C的含量。與張久盤[21]文中A+T含量為56.8%，G+C含量為43.2%；馮曉宇[22]文中的A+T含量為56.6%，G+C含量為43.4%，研究結果相一致，均表現出堿基偏倚性，符合大多數硬骨魚的特征[22]。

3.2 翹嘴鲌地理群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物進化和適應環境的基礎，黃小彧[11]等對線粒體DNA序列遺傳變異的研究表明，若單倍型多樣度(Hd)高于0.5且核苷酸多樣度(Pi)低于0.005，是受瓶頸效應后群體快速擴張導致，表明該群體的遺傳多樣性水平低；如果單倍型多樣度(Hd)高于0.5且核苷酸多樣度(Pi)高于0.005，則該群體遺傳多樣性水平較高[23]。本研究中整個翹嘴鲌群體的遺傳多樣性水平較高，遺傳多樣性豐富，與徐丹丹[24](Hd:0.948，Pi:0.017)，徐宇[25](Hd:0.969，Pi:0.2008)和張久盤[21](Hd:0.998，Pi:0.039)的研究結果一致。本研究中長江群體表現出高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，與黃小彧等[11]的結果(Hd:0.866，Pi:0.00330)存在差異，可能是黃小彧等研究中使用的是線粒體控制區，控制區是線粒體DNA的高突變區；還可能是近幾年長江的水域魚類生境優化和資源恢復措施導致長江翹嘴鲌的遺傳多樣性較高。

遺傳多樣性的高低通常由遺傳距離的大小來反映，種內個體間遺傳距離小，彼此間親緣關系近，說明遺傳多樣性低，反之，遺傳距離大則遺傳多樣性高[17]。本研究中4個地理群體的種內遺傳距離的范圍是0.01～0.04，其中長江群體和長蕩湖群體的種內遺傳距離相同且最大，遺傳多樣性較高，太湖群體的種內遺傳距離最小，遺傳多樣性也較低，與王偉等[17]的研究結果一致。通常情況下，地理距離越遠，群體間遺傳距離也就越大，而徐丹丹等[24]在基于微衛星標記和線粒體Cyt b基因序列針對鲇(Silurus asotus)遺傳多樣性的研究一文中，發現不同鲇群體遺傳距離與其地理距離之間沒有相關性；沙航等[26]基于COI序列分析長江中上游6個鰱(Hypophthalmichthys molitrix)地理群體遺傳多樣性也斧正了遺傳距離的大小與群體地理距離沒有明顯相關性。本研究中淀山湖距離長蕩湖比距離太湖遠，但淀山湖群體與長蕩湖群體的遺傳距離小于淀山湖群體與太湖群體的遺傳距離，這3個湖泊的翹嘴鲌群體之間遺傳距離與其分布的地理距離亦沒有相關性，這一結果與上述研究結果類似。

群體遺傳學中通常以Fst值的大小作為衡量群體間遺傳分化程度的常見指標，Fst＜0.05表示群體間是低度分化；0.05＜Fst＜0.15 表示群體間是中度分化；0.15＜Fst＜0.25表示群體間是高度分化；0.25＜Fst＜1表示群體間有極大的遺傳分化[27]。本研究中長江翹嘴鲌群體和長蕩湖群體的Fst相對較小，為0.197，屬于高度分化，長江群體、淀山湖群體和太湖群體間的Fst值較大，屬于極大分化，這有可能是研究水域存在地理隔離，翹嘴鲌群體間不存在基因交流。群體間平均凈遺傳距離(Da)是衡量群體間分化程度的重要指標，值越大，群體間的遺傳分化程度越大[24,28]。長蕩湖和太湖群體的平均凈遺傳距離相對其它群體之間較大(0.48)，遺傳分化程度高，與其遺傳分化指數較高的研究結果相一致。本研究中4個群體之間的基因流值都小于4，研究結果進一步說明了4個翹嘴鲌群體之間基因交流較少，存在一定程度的遺傳分化現象，這與陳會娟等[29]的結果一致。

3.3 翹嘴鲌群體歷史動態

一般要判斷某一群體有沒有發生過群體擴張，有兩種方法：中性檢測和歧點分布分析[11,30-31]。本研究用這兩種方法來分析了翹嘴鲌群體的種群歷史動態情況。當檢測數值為負值，且具有顯著意義時，則認為該群體曾發生過群體擴張現象，如果群體發生過擴張，則歧點分布圖呈現出單峰；如果群體未經歷過擴張，呈現穩定狀態，則其歧點分布圖呈現為多峰[11]。對211個翹嘴鲌個體的Cyt b中性檢驗得出Tajima's D值，除了長蕩湖群體，其余群體都為負值，且長江和太湖群體的Tajima's D表現出極顯著性差異P＜0.01，表明群體在歷史上曾發生過群體擴張。淀山湖群體的Tajima's D為負值，但不具有顯著性差異。除此之外，歧點分布圖顯示，4個翹嘴鲌地理群體的錯配分布曲線中，將所有翹嘴鲌群體作為一個整體分析，錯配曲線呈現單峰，說明該翹嘴鲌群體發生過群體擴張，這與張力文等[23]的結果相一致。

4 結論

本研究對4個水域的翹嘴鲌進行遺傳多樣性和遺傳結構的分析，采樣點覆蓋長江下游典型水域，樣本較多。結果顯示4個地理水域的翹嘴鲌群體，表現出高的單倍型和高的核苷酸多樣性，遺傳多樣性較為豐富，群體間都存在遺傳分化，分化程度不同。研究表明，線粒體DNA Cyt b可以作為評估翹嘴鲌的遺傳多樣性和種質資源現狀的有效分子標記，研究結果為翹嘴鲌種質資源評估和保護提供了科學的數據支撐。后續研究將繼續增加野生翹嘴鲌群體的樣品數量和研究水域，采用多種分子標記方法，全面而系統的評估長江下游各個水域翹嘴鲌的種質資源狀況和分析其遺傳結構。