轉基因玉米CM8101特異性定性PCR檢測方法

龍麗坤，趙 寧，夏 蔚，李蔥蔥，董立明，閆 偉，李飛武

（吉林省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，長春 130033）

0 引言

生物技術為全球農業科技注入強大的動力。轉基因玉米是全球獲得商業化批準最多的轉基因作物。根據ISAAA(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)最新統計顯示，2018年全球已批準商業化種植轉基因作物31種，包括的517種轉化體中237種為轉基因玉米[1]。抗蟲、耐除草劑轉基因玉米品種選育是中國轉基因專項重點研發領域之一。自2008年重大科技專項啟動以來，中國轉基因作物自主研發能力顯著提升，大量轉基因玉米新品系陸續進入環境安全評價階段。CM8101轉基因玉米是中國農科院自主研發，通過外源導入Cry1Ab-Ma和bar基因，具有優良的抗蟲性和除草劑耐受性，是國內具有推廣應用前景的轉基因玉米新品系之一。對新品系CM8101轉基因玉米建立準確可靠的檢測方法，不僅是轉基因產業發展的必然要求，也是中國轉基因生物安全監管的技術支撐[2]。

目前，轉基因作物檢測主要基于核酸和蛋白質開展鑒定和分析[3]。基于核酸的轉基因檢測技術除傳統PCR檢測技術之外，等溫擴增技術(LAMP)[4]、基因芯片技術(Gene chip)[5]、數字PCR技術(Digital PCR)[6-7]和生物傳感器(Biosensor)[8]等新型檢測技術也不斷研發和應用，但這些新技術也存在問題和不足，如設備專業性強，技術要求高、易污染等。基于核酸的PCR定性檢測方法具有成本低、靈敏度高、特異性強、操作相對簡單等特點，成為國家標準、行業標準等推薦的主要轉基因檢測技術，并被廣泛應用于研發單位和檢測機構。CM8101作為新的轉基因玉米品系，其特異性定性PCR檢測方法尚未建立。本研究以抗蟲、耐除草劑玉米CM8101轉化體3’端插入位點的特異性序列為依據，建立轉化體特異性定性PCR檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、重復性進行測試，旨在為對該轉化體的安全評價、行政監管提供重要的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 轉基因玉米CM8101、非轉基因對照玉米Z58均為玉米純合體，由中國農科院提供。

特異性測試樣品中其他轉基因玉米、轉基因大豆、轉基因棉花和轉基因油菜等樣品為粉末標準品，均由本實驗室收集保存，涉及的各類作物轉化體見表1。多種轉化體按質量分數混合，分別制成混合樣品，每個轉化體含量為1%，以同種非轉基因作物粉末為填充物。

表1 特異性測試包含的轉基因作物

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。Premix Ex Taq(Perfect Real Time)、DL2000分子量Marker購于大連寶生物工程有限公司。引物由上海生工生物公司合成。其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器設備 臺式冷凍離心機（美國eppendorf）、ND8000紫外分光光度計(Thermo scientific)、C1000型梯度PCR儀、GelDoc XR+凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將所有樣品粉末，按照植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化）操作說明書提取樣品基因組DNA，ND8000紫外分光光度計測定DNA質量和濃度，用1×TE緩沖液將純化的DNA溶液稀釋至12.5 mg/L。

1.2.2 引物序列 CM8101玉米特異性擴增引物：8101-F7：5’-GGAAGCATAAAGTGTAAAGCC-3’；8101-R7：5’-CATTTCTTGGTCAAAACCTCAC-3’。擴增產物大小為242 bp。

內標準基因采用zSSIIb基因，參考農業部1861號公告-3-2012《轉基因植物及其產品成分檢測玉米內標準基因定性PCR方法》，引物序列為：zSSIIb-1F：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’；zSSIIb-2R：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3’。擴增產物大小為151 bp。

引物由上海生工有限公司合成，用1×TE緩沖液稀釋至10 μmol/L的工作液。

1.2.3 PCR反應 PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs混合溶液2 μL、10 μmol/L上下游引物各 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O補齊至25 μL。

PCR擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35個循環；72℃ 7 min；10℃。PCR擴增結束后，10 μL擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結果與分析

2.1 轉化體特異性引物設計

根據CM8101玉米5’端和3’端邊界序列信息（發明專利CN 109536490 A），采用引物設計軟件Premier 5.0，設計轉化體特異性引物7對，引物序列、位置及擴增產物大小等信息見表2。通過對低濃度DNA樣品的測試，根據引物擴增條帶清晰度、非特異性擴增以及引物二聚體多少等，選擇表現相對優異的3’端引物序列8101-F7/8101-R7作為方法候選引物進行后續方法參數的測定。3’端邊界序列及引物8101-F7/R7位置見圖1。

表2 CM8101玉米特異性定性PCR檢測引物信息

圖1 CM8101玉米的3’端邊界序列及引物位置

2.2 特異性檢測

將CM8101制成質量分數1%的粉末，陰性對照為非轉基因玉米粉末，其他轉基因玉米混合樣品、轉基因大豆混合樣品、轉基因水稻混合樣品、轉基因棉花油菜混合樣品、轉基因油菜混合樣品，作為特異性測試樣品（見表1），提取樣品DNA，按照常規PCR普通擴增體系進行內參基因zSSIIb和CM8101特異性片段的PCR擴增，測試本方法特異性。

內源zSSIIb基因擴增，作為DNA樣品質量和純度的質控，經PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖2所示，僅在陰性玉米、CM8101玉米和其他轉基因玉米出現玉米內源基因擴增條帶(151 bp)，表明測試樣品適用于特異性檢測。

圖2 特異性測試樣品內標準基因zSSIIb擴增結果

CM8101特異性片段擴增電泳圖譜見圖3所示，僅在CM8101玉米樣品中擴增出與預期大小一致的特異性PCR產物(242 bp)，其他轉基因玉米、轉基因大豆、轉基因水稻、轉基因油菜、轉基因棉花樣品中未得到任何擴增。因此，特異性檢測結果表明，本方法具有嚴格特異性。

圖3 特異性測試樣品CM8101特異性片段擴增結果

2.3 靈敏度測試

將CM8101玉米基因組DNA與其非轉基因玉米對照樣品DNA按不同質量比混合，制成DNA質量分數分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的CM8101玉米樣品，進行方法靈敏度測試。每個擴增體系模板用量均為50 ng玉米基因組DNA，內參基因zSSIIb的擴增用于判定作為DNA樣品提取質量如圖4所示。特異性片段靈敏度測試結果如圖5所示，PCR檢測反應體系中加入50 ng玉米基因組DNA模板時，在電泳圖譜上顯示，1%～0.05%的特異性片段均有預期片段擴增，擴增產物經測序證實，該片段為預期的特異性序列。

圖4 靈敏度測試樣品內標準基因zSSIIb擴增結果

圖5 靈敏度測試樣品CM8101特異性片段擴增結果

2.4 檢出限測定

為確定本方法檢出限，借鑒中國已發布實施的轉基因產品定性PCR檢測方法標準的技術要求，使用CM8101玉米和非轉基因玉米對照樣品基因組DNA混合配制60份CM8101玉米DNA含量為0.1%的樣品，進行PCR擴增。

結果如圖6所示，60份試樣均穩定擴增出預期大小一致的PCR產物，表明在PCR檢測反應體系中加入50 ng DNA模板時，本方法的檢出限可達到0.1%。單拷貝玉米基因組雙鏈DNA的平均質量約為2.5 pg，由于本研究中使用CM8101玉米為純合體，因此，本檢測方法的檢出限約20拷貝。因此，本方法適用于對抗蟲耐除草劑玉米CM8101品系的高靈敏檢測。

圖6 CM8101玉米檢測方法檢出限測定

2.5 穩健性測試

為了測試本特異性PCR方法對CM8101檢測的穩健性，針對PCR檢測方法的反應體系和反應程序，以1%的CM8101為模板，選擇退火溫度和引物濃度梯度2個關鍵參數進行正交試驗。退火溫度設置分別為52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃，引物濃度梯度為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，共測試24個退火溫度/濃度梯度組合。結果見圖7，圖中可見，不同的引物濃度和退火溫度處理中本方法均表現出良好的擴增特異性，不同退火溫度表現出較為一致的擴增效率，特異性擴增條帶清晰、無非特異擴增、引物二聚體較少，因此本方法可以穩定地檢出CM8101特異性片段，再現性良好。

圖7 CM8101玉米特異性PCR法退火溫度的穩定性測試

綜合考慮玉米內標準基因zSSIIb的定性PCR檢測方法的反應體系和反應程序，結合本研究結果，反應體系中的引物終濃度建議采用0.2 μmol/L，反應程序中的退火溫度設定為58℃。

3 討論

隨著轉基因新品種研發和產業化推進，作物安全評價和監管面臨更多挑戰，迫切需要不斷開發更精準、快速、高通量檢測方法提供技術支撐[9-10]。PCR技術是應用最廣泛的轉基因檢測方法，以PCR為主要技術手段的轉基因檢測分為4類，即轉化元件篩選檢測[11]、靶標基因檢測[12-14]、構建載體特異性檢測[15]和轉化體特異性檢測[16]。Datukishvili等[17]建立了CaMV35S、Nos、EPSPS和Cry1Ab4個轉基因參數的多重PCR檢測體系，檢測限可以達到0.1%的RRS大豆和MON810玉米。應用數字PCR技術Fu等[18-20]，建立了無需預處理的定性篩選檢測方法，實現了轉基因作物的快速篩選。但研究表明，此類方法對多種轉基因轉化體難以達到一致的檢測限。對新研發的轉基因作物，仍需驗證其適用性。

轉基因抗蟲耐除草劑玉米CM8101是由中國農科院研發的轉Cry1Ab-Ma基因和bar基因抗蟲耐除草劑玉米新品系，經多年多點鑒定表明，該品系對玉米螟、棉鈴蟲、粘蟲等鱗翅目害蟲具有良好的抗蟲性、同時兼具草銨膦除草劑耐受性，在中國具有重要產業化應用前景，因此，對CM8101轉基因玉米建立一種穩定可靠的特異性檢測方法是安全評價和監管的必要支撐。

轉化體特異性PCR檢測方法靶標主要是外源插入序列與靶標物質基因組連接區域的DNA序列，這種方法具有高度的專一性，是轉化體特異性檢測的最廣泛應用的檢測方法，已成為國際上轉基因作物研發和安全評價中的基本技術要求[21]。目前，大多數商業化轉基因作物品系均已建立定性PCR檢測體系，應用于轉基因品系特異性鑒定和分析。Jae-HwanKim等應用多重PCR技術建立了16種轉基因玉米五重PCR鑒定方法[22]。利用Realtime PCR技術各國學者陸續建立了轉基因玉米BVLA430101、98140等轉化體特異性定性定量檢測方法[23-24]，這些新方法檢測特異性強，檢測限達到0.1%～0.25%。但這些方法普遍存在技術要求較高、需要標準物質等問題。本研究建立的CM8101凝膠檢測的定性PCR檢測方法，設備普及率高，成本低，技術適用范圍廣。本方法檢測靈敏度達到0.1%，檢測限為20 copies，與各類新方法達到相同的分辨力水平。因此易于在中國眾多研發單位和檢測機構推廣應用[25]。

本研究以轉基因玉米CM8101 3’端插入位點特異性序列為依據，通過篩選檢測引物、優化反應體系、反應程序等技術參數測試，建立了CM8101的轉化體特異性定性PCR檢測方法，達到了與現行有效的其他同類轉基因植物及其產品成分檢測方法標準相同的技術指標，同時本方法考慮到與其他相關國家標準的兼容性，確保在實際工作中能夠將本方法與其他標準高效配合使用。

4 結論

基于轉基因玉米CM8101的3’端特異序列，應用普通PCR技術，本研究建立了CM8101定性鑒定方法。結果表明：本方法能夠精準檢測出CM8101玉米樣品，具有良好的品系特異性，方法檢測靈敏度可達0.1%。本方法各項技術指標能夠滿足《農業轉基因生物安全管理條例》轉基因作物安全監管的技術要求，可為轉基因玉米CM8101的鑒定提供有效的技術手段。