轉基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發育階段cry2A*基因表達量

李榮田，于曉晨，孔夢瑩，劉長華,3

（1黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；3黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

水稻(Oryza sativa)，是中國及世界重要的糧食作物[1]。螟蟲特別是二化螟和三化螟的危害造成水稻嚴重減產，危害最大的二化螟在中國南北稻區都有分布[2]。黑龍江省是中國最大的粳稻產區，自1998年在五常市稻田首次發現二化螟以來，螟蟲危害快速蔓延，逐年加重。中國每年投入大量人力、財力進行藥劑防治水稻蟲害，但蟲害造成的損失仍然十分嚴重[3-4]。培育抗蟲水稻品種是防治蟲害最經濟有效的措施[5-6]。由于水稻及其近緣種缺乏抗螟蟲基因，利用傳統雜交方法難以培育出抗蟲品種。通過轉基因技術將外源抗螟蟲基因導入水稻中，為培育高抗螟蟲水稻提供了新思路[7-8]。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是革蘭氏陽性菌，可以形成Bt殺蟲晶體蛋白，對鱗翅目害蟲有很高的、專一的殺蟲性，且不會對人類產生毒害[9-10]。cry2A是編碼Bt蛋白質的基因之一，以cry2Aa基因為藍本，在其編碼蛋白質氨基酸順序不變的條件下，根據水稻密碼子偏愛性進行密碼子優化并人工合成了cry2A*基因。轉cry2A*基因秈稻表現出穩定的、較好的抗螟蟲性[11]。水稻‘空育131’是北方粳稻及黑龍江省歷史上年種植面積最大的常規品種，利用根瘤農桿菌Ti質粒介導法，將cry2A*基因導入水稻‘空育131’中，創制了轉基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨立系。Bt植物的抗蟲能力強弱與Bt蛋白含量(Bt Protein Content,BPC)有關。Bt水稻生長發育過程中外源目的基因表達是動態變化的，白耀宇等[12]研究發現，葉片及莖鞘BPC抽穗期較低，灌漿期顯著升高；華樺[13]認為，葉片及莖鞘BPC孕穗期最高，然后逐漸降低；陳耕[14]報道，葉片BPC成熟期最高，莖鞘BPC分蘗期最高；于志晶等[15-16]認為，分蘗期、抽穗期以及灌漿期的葉片BPC差異并不大。不同研究關于Bt水稻外源目的基因表達量動態變化過程的研究結論存在著差異，其原因可能在于轉基因Bt水稻材料及生長發育環境不同，外源基因表達能力不同，因此研究轉cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨立系在黑龍江省田間不同生長發育階段目的基因的表達量是十分必要的。本研究將水稻‘HD2-1’等獨立系種植在田間，分別于分蘗期、抽穗期及灌漿期檢測有關器官cry2A*基因表達量以及糙米BPC，分析不同生長發育階段外源目的基因表達量的關系，以期為培育及利用寒區轉基因抗蟲水稻品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 水稻

水稻材料為‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨立系。以早粳稻‘空育131’為受體，利用根瘤農桿菌Ti質粒介導的遺傳轉化法創制轉Bt基因cry2A*早粳稻。攜帶cry2A*基因Ti質粒的T-DNA區見圖1。遺傳轉化水稻以獨立抗性愈傷組織系（下稱獨立系）為單位，在溫室內以生長發育正常、外源基因bar和cry2A*等PCR檢測陽性、抗除草劑Basta、Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測陽性、室內高抗二化螟等為指標，每個獨立系每個世代選擇1株，直至穩定世代形成水稻‘HD2’，即為攜帶外源基因bar和cry2A*的轉基因抗蟲水稻。‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等是來自于不同獨立系的水稻‘HD2’。

圖1 植物表達載體pbar-cry2A*的T-DNA區

受體水稻‘空育131’作對照。

1.2 Basta抗感性檢測

培育供試水稻秧苗，秧苗3葉1心期用Basta處理。Basta即除草劑草丁膦或草銨膦，有效成分是膦絲菌素。將含膦絲菌素0.5%的Basta工作液均勻地噴施在供試水稻葉片上，連續7天觀察水稻植株的變化并記錄其抗感Basta情況[17]。

1.3 PCR檢測

水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨立系抗Basta的秧苗及對照‘空育131’的秧苗，每個供試水稻隨機取5株，每株取1片嫩葉，用CTAB方法[18]提取DNA。對水稻DNA樣品分別進行actin基因（內參基因）、bar基因及cry2A*基因的PCR檢測。PCR所需的引物序列及預期產物大小如表1所示。

PCR反應體系：水稻模板DNA 1.5 μL，actin、bar或cry2A*正向引物 0.5 μL(10 μmol/L)，actin、bar或cry2A*反向引物0.5 μL(10 μmol/L)，2 ×TaqPCR Master Mix 5.15 μL，ddH2O 12.35 μL，總體積為20 μL。

PCR 擴 增程序(actin)：94℃，3 min；94℃ 變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35循環；72℃，8 min；4℃儲存。

PCR擴增程序（bar或cry2A*）：94℃，3 min；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，32循環；72℃，8 min；4℃儲存。

PCR完成后，在產物中加2 μL 6×loading buffer，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗條帶的有無。

1.4 Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測

供檢測的水稻樣品同1.3。利用武漢上成生物科技有限公司的Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測水稻‘HD2’cry2A*基因是否表達Bt蛋白，操作步驟按膠體金免疫層析試紙條使用說明書進行。

1.5 本田試驗設計及cry2A*基因表達量檢測

1.5.1 試驗設計 2020年正季，在黑龍江大學呼蘭校區轉基因水稻試驗田(126°38'25.25"E,45°59'47.70"N)種植水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨立系及對照‘空育131’。本田田間試驗設計采用隨機區組法，3次重復。小區6行區，行長5 m，插秧規格為行距30 cm，株距12 cm，每蔸插1棵秧苗，小區面積為9 m2。育苗、插秧、施肥、水管理、防病等與一般生產田相同，不進行二化螟等蟲害防治。在水稻分蘗期、抽穗期和灌漿期，從田間每小區隨機選取3蔸水稻，取每蔸主莖，將主莖分為最上部完全展開葉葉片、莖鞘及幼穗等3個器官，每個器官分別準確取100 mg及大約取20 mg左右2份，用滅菌的錫箔紙包好置液氮中保存，用于檢測cry2A*基因的mRNA表達量及BPC。收獲期田間每小區收獲稻谷，室內充分干燥后加工成糙米，從各小區糙米中取出3份20 mg左右的樣品用于檢測糙米BPC。

1.5.2 mRNA表達量檢測 實時熒光定量PCR方法檢測供試水稻cry2A*基因mRNA表達量[19]。操作步驟如下。

（1）總RNA的提取：利用生工生物工程（上海）股份有限公司的UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，按照說明書提取水稻樣品總RNA，檢測總RNA的純度及完整性并置于-80℃冰箱中保存備用。

（2）逆轉錄合成cDNA：用生工生物工程（上海）股份有限公司的M-MuLV第1鏈cDNA合成試劑盒，依據其說明書對RNA進行反轉錄合成cDNA。

（3）qRT-PCR：使用TaKaRa TB Green?Premix Ex Taq?II試劑盒，利用Bio-Rad iQTM2多重實時熒光定量PCR儀進行cry2A*基因的qRT-PCR檢測。qRT-PCR內參基因actin的正向引物為5‘TCGTGTAGCACCAGAAGAGCA3’，反向引物為5‘TCCACTAGCATAGAGGGAAAGC3’；cry2A*目的基因的正向引物是5‘TTCCTGCTGAAGAAGGTGGGT3’，反向引物是 5‘ACGAGCGAGGGTGTCAGTGTT3’。qRT-PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 反應體系20 μL，水稻cDNA 2 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL，actin或cry2A*基因正向引物(10 μmol/L)0.8 μL，actin或cry2A*基因反向引物(10 μmol/L)0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 擴增程序：95℃，3 min；(95℃，10 s；57℃，30 s)，40個循環，實時采集熒光強度信號；95℃，1 min；57℃，1 min；57℃，10 s（溫度變化范圍 57～95℃），77個循環，自第2個循環開始每個循環上升0.5℃，實時采集熒光強度信號并形成溶解曲線。

（4）cry2A*基因mRNA表達量：以內參基因actin為標準，以水稻‘空育131’為對照，利用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達量[20]。

1.5.3 Cry2A蛋白含量檢測 利用武漢上成生物科技有限公司“轉基因Bt Cry2A酶聯免疫定量檢測試劑盒”檢測水稻樣品cry2A*基因BPC，具體步驟見參考李榮田等[21]的研究方法。

1.6 數據處理

每個小區不同生長發育階段各器官的3個水稻樣品為3次技術重復，cry2A*基因mRNA表達量及BPC 3次技術重復間差異不得大于5%，3次技術重復的平均值為小區值，以小區值進行差異顯著性檢測及相關分析。

2 結果與分析

2.1 水稻‘HD2’外源基因的整合及表達

Basta抗感性檢測、PCR檢測及Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測結果見圖2。由圖2可知，在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨立系各植株中都整合了bar及cry2A*基因，并且耐除草劑Basta及Cry2A蛋白陽性。說明水稻‘HD2’等獨立系攜帶bar和cry2A*等外源基因，并且外源基因能夠穩定表達。

圖2 轉基因水稻‘HD2’外源基因的整合及表達

2.2 水稻‘HD2’cry2A*基因表達量

轉基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發育階段目的基因cry2A*的mRNA表達量見表2。由表2可知，在葉片和莖鞘中‘HD2’水稻cry2A*基因mRNA表達量生長發育前期相對較低，后期相對較高；幼穗中生長發育前期較高，后期較低。水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期的各器官mRNA表達量在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’之間存在著顯著或極顯著差異。

表2 水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA表達量

轉基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發育階段各器官Cry2A蛋白含量見表3。由表3可知，‘HD2’水稻成熟期糙米中的Cry2A蛋白含量與生長發育過程組織器官BPC比較是最低的；在葉片、莖鞘中，Cry2A蛋白含量最高的生長發育時期為灌漿期，其次為抽穗期、分蘗期；在幼穗中，Cry2A蛋白含量最高的生長發育時期是抽穗期，其次是灌漿期。水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期各器官及糙米的BPC在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨立系間存在著極顯著差異。

表3 水稻‘HD2’Cry2A蛋白含量

2.3 水稻‘HD2’cry2A*基因表達量不同生長發育階段間的關系

轉基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發育階段cry2A*基因表達量關系見圖3。圖3A顯示，‘HD2’水稻cry2A*基因mRNA表達量，在葉片中，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期及分蘗期與灌漿期之間呈顯著正相關；在莖鞘中，分蘗期與灌漿期之間呈顯著正相關，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期之間呈正相關趨勢；在幼穗中，抽穗期與灌漿期呈顯著正相關。說明，轉cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2’組織器官的cry2A*基因mRNA表達量在不同生長發育階段間具有正向關系，前期目的基因mRNA表達量高，后期往往也高。

圖3 水稻‘HD2’cry2A*基因表達量在不同生長發育階段間的關系

圖3B顯示，‘HD2’水稻Cry2A蛋白含量在葉片中，分蘗期與抽穗期呈顯著正相關，抽穗期與灌漿期及分蘗期與灌漿期之間有正相關趨勢；在莖鞘中，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期之間呈顯著正相關，分蘗期與灌漿期之間呈正相關趨勢；在幼穗中，抽穗期與灌漿期呈顯著正相關。這表明，轉cry2A*基因抗蟲水稻組織器官中BPC在不同生長發育階段具有正相關關系，前期Bt含量高，后期含量往往也高。

2.4 水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA表達量和BPC的關系

水稻‘HD2’各器官不同生長發育階段cry2A*基因mRNA表達量和BPC的關系見圖4。圖4顯示，在葉片、莖鞘及幼穗等器官中，cry2A*基因mRNA表達量和BPC均呈極顯著的正向直線關系。這說明，在轉cry2A*基因抗蟲水稻整個田間生長發育時期，器官組織中目的基因轉錄水平表達量高，翻譯水平表達量通常也高。同時，暗示著水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA及其蛋白質在水稻細胞中具有穩定性。

圖4 水稻‘HD2’生長發育過程cry2A*基因mRNA表達量和BPC的關系

2.5 水稻‘HD2’糙米BPC與cry2A*基因表達量的關系

水稻‘HD2’糙米BPC與不同生長發育階段各器官cry2A*基因表達量的關系見圖5。圖5A顯示，水稻‘HD2’糙米BPC與分蘗期葉片和莖鞘、抽穗期幼穗及灌漿期葉片cry2A*基因mRNA表達量呈顯著正相關，與灌漿期莖鞘和幼穗cry2A*基因mRNA表達量呈極顯著正相關，與抽穗期葉片和莖鞘的cry2A*基因mRNA表達量有正相關趨勢。這表明，轉cry2A*基因抗蟲水稻糙米BPC和生長發育過程中的組織器官里的目的基因轉錄水平具有正相關關系，特別是與生長發育中后期的幼穗目的基因轉錄水平的正相關關系更緊密。

圖5 水稻‘HD2’糙米BPC與不同生長發育階段cry2A*基因表達量的關系

由圖5B可知，水稻‘HD2’糙米BPC與分蘗期及抽穗期的葉片Cry2A蛋白含量呈正相關趨勢，與分蘗期的莖鞘、抽穗期的莖鞘和幼穗及灌漿期的葉片、莖鞘和幼穗Cry2A蛋白含量呈顯著或極顯著的正相關。這說明，轉cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2’糙米BPC與生長發育過程中的組織器官的BPC具有正相關關系，特別是與生長發育中后期的目的基因翻譯水平表達量正相關關系更明顯。

3 結論

轉基因抗蟲水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等不同的獨立系，田間不同生長發育階段各器官cry2A*基因mRNA表達量及其蛋白質含量明顯不同，糙米BPC也存在著明顯差異。葉片、莖鞘及幼穗等器官cry2A*基因表達量在不同生長發育階段間具有正相關或正相關趨勢，前期表達量高的材料往往后期表達量也高。

水稻‘HD2’田間生長發育期間組織器官cry2A*基因mRNA表達量和BPC呈極顯著的正相關關系，目的基因轉錄水平表達量高，翻譯水平表達量也高。

水稻‘HD2’糙米BPC與田間生長發育時期的葉片、莖鞘及幼穗等器官cry2A*基因mRNA表達量、BPC具有正相關或正相關趨勢，田間生長發育時外源目的基因表達量高，糙米BPC往往也高。

4 討論

關于Bt植物目的基因表達量不同生長發育階段間的關系，轉基因楊樹葉片Bt基因的轉錄及翻譯水平表達量在前期和后期間均存在正相關[22]，Bt棉主莖功能葉BPC在不同生長階段間未見正相關關系[23]。本研究顯示，轉基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨立系葉片、莖鞘及幼穗cry2A*基因mRNA表達量和BPC在不同生長發育階段間存在正相關關系。關于Bt植物目的基因mRNA表達量和BPC的關系，夏蘭芹等報道，Bt棉目的基因mRNA和Bt殺蟲蛋白含量存在正相關趨勢，但未達顯著水平[24]。孫玥研究不同受體品種的轉Bt基因水稻抽穗期葉片、莖稈及穎殼中Bt基因mRNA表達量與BPC間的關系，發現了與Bt棉類似的現象，即目的基因轉錄水平和翻譯水平表達量存在著正相關趨勢[25]。但是，本研究結果表明，水稻‘HD2-1’等獨立系生長發育過程中組織器官中Bt基因mRNA表達量和BPC呈極顯著的正相關關系。本研究的抗蟲轉基因水稻獨立系是同一個受體品種、具有相同的外源基因卡盒、來自于不同的轉化事件，最大程度地排除了基因表達框架和遺傳背景差異的影響，研究結果可能更符合客觀情況。種植在田間的、同一受體品種及T-DNA區的不同的轉基因水稻，外源基因轉錄或翻譯水平生長發育前期表達量高、中后期往往也高，生長發育過程中目的基因轉錄水平表達量高、翻譯水平表達量也高。

Bt水稻目的基因蛋白含量與田間抗蟲性呈正相關，BPC太低的轉基因水稻沒有抗蟲性[26]，當BPC超過一定閾值時，植株田間均表現為高抗蟲性[21]。本研究中的水稻材料經過了抗二化螟選擇，雖然不同材料cry2A*基因表達量不同，但是是在較高表達量范疇的差異。糙米是水稻重要的經濟器官，本研究顯示轉基因抗蟲水稻糙米BPC和田間生長發育時外源目的基因表達量存在正相關。從稻米消費者的心理角度出發，在培育轉基因抗蟲水稻品種工作中，需要注意“高中選低”，即從外源目的基因表達量較高的抗蟲材料中選擇表達量較低的基因型。