2種分子質量的絲膠蛋白對間充質干細胞黏附活性的探究

王志強 張慧華(南陽市經濟作物技術推廣站，河南南陽 473000； 河南民興生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

蠶絲由內層絲素和外層絲膠2部分組成[1]，絲膠包覆在絲素外圍，對絲素起著保護和膠黏作用，可防止因織造摩擦對絲纖維的損傷[2]，一般要到染色、整理工序時才將絲膠全部脫凈[3]。絲綢絹紡廠精練液的廢水中含有濃度極高的絲膠蛋白[4]，直接排放流入河道會消耗水中的溶解氧，使水體喪失自凈能力，破壞人類生態環境。但是，以往很多工廠都是將絲膠廢水作為環境污染物處理，絲膠的價值沒有得到很好的利用，而又容易造成環境污染。而絲膠的提取[5]和利用一方面可以減輕絲膠廢水對自然環境造成的壓力，另一方面將絲膠作為自然資源開發并利用，對增加經濟效益也具有深遠的意義。絲膠蛋白以其獨特的優異性能，用途日趨擴大，產品日益增多，現已廣泛應用在化妝品添加劑[6]、醫藥[7]、織物后整理涂層[8]以及功能性生物材料[6]等方面。近年來，絲膠蛋白作為生物材料的應用研究日趨活躍，明確絲膠蛋白的細胞相容性[9-10]是絲膠蛋白在醫學組織工程材料[11]領域應用的必要前提，而其良好的細胞黏附活性是絲膠蛋白細胞相容性的突出表現之一。然而，現階段對從廢水中回收的絲膠蛋白的相對分子量鮮有報道，且其細胞相容性暫不明確，為此開展了從廢水中回收不同分子量大小的絲膠蛋白對細胞的影響試驗，以期為絲膠蛋白在醫學組織工程的進一步開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試絲膠蛋白粉 利用膜過濾技術從桑條吐精煉液中提取的高分子量絲膠蛋白(HS)和低分子量絲膠蛋白(LS)，河南民興生物科技股份有限公司絲膠提取設備生產，蛋白質含量93.6%(純度93.6%)，具體生產方法參見文獻[12]。

1.1.2 主要試劑 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)無血清培養基套裝(MSC基礎培養基+MSC無血清添加劑)、胰蛋白酶消化液、小牛血清(FBS)，均購自北京科霖恩生物科技有限公司，以上試劑均為細胞級；間充質干細胞，由北京科霖恩公司郭子寬教授贈送；碳酸鈉、檸檬酸三鈉、濃鹽酸、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自國藥試劑，均為分析純；三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) methyl aminomethane THAM，Tris]、4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)、四甲基乙二胺(N，N，N′，N′-tetramethyl ethylenedia mine，TEMED)、過硫酸銨(ammonium persulphate，APS)、甲醇、冰醋酸、蛋白標準品Marker(M①11.0～180.0 kD、M②14.4～97.4 kD、M③3.3～20.1 kD)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、甘氨酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、考馬斯亮藍 G-250，購自北京索萊寶有限公司，均為分析純；噻唑藍(MTT)、木瓜蛋白酶、纖維素酶、纖維連接蛋白(fibronectin，FN)，購自美國-Sigma-公司，均為分析純。

1.1.3 主要儀器設備 溫水浴鍋、PHS-3E型pH計、超純水機、鼓風干燥箱，均為浙江力辰儀器科技有限公司產品；752N型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品；DYY-300型電泳儀，美國Bio-Rad公司產品；二氧化碳培養箱、生物安全柜、酶標儀、電動移液器，均為Thermo公司產品；電子天平，精度0.001 g，上海恒平科學儀器有限公司產品；磁力攪拌器，常州市金壇大地自動化儀器廠產品；血球計數板、96孔細胞培養板、150 mm細胞培養皿、50 mL離心管、移液管，均為美國Corning公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離膠的配制 取27.23 g的Tris溶解于80 mL 蒸餾水中，用鹽酸調pH值至8.8，蒸餾水定容至150 mL。量取其中20 mL溶液，加入40 mL 30%的丙烯酰胺貯液、1 mL 10%的SDS和18 mL蒸餾水混勻，即配制成15%的分離膠，于4 ℃保存備用；量取其中的20 mL溶液，加入54 mL 30%的丙烯酰胺貯液、1 mL 10%的SDS和4 mL蒸餾水混勻，即配制成20%的分離膠，于4 ℃保存備用。分別量取15%和20%的分離膠9.95 mL，加入100 μL 10%的APS和5 μL的TEMED混勻，灌入膠板中，上層加入蒸餾水封口，等待分離膠凝固，即制成15%和20%的分離膠膠板。

1.2.2 濃縮膠的配制 (1)將6.00 g的Tris溶解于60 mL 蒸餾水中，用鹽酸調pH值至6.8，蒸餾水定容至100 mL。(2)量取步驟(1)中的溶液2.5 mL，加入3.4 mL 30%的丙烯酰胺貯液、0.2 mL 10%的SDS和13.6 mL蒸餾水混勻，于4 ℃保存備用。(3)量取步驟(2)中的溶液10 mL，加入20 μL 10%的APS和10 μL的TEMED混勻，待1.2.1項的分離膠凝固后，倒出表面的水層，將配制好的濃縮膠灌入膠板中，然后插入梳子，等待凝固，即制成15%和20%的分離膠體系。

1.2.3 完全培養基的配制 量取16 mL的MSC基礎培養基于50 mL離心管中，加入4 mL的FBS，用MSC基礎培養基定容至20 mL，即為完全培養基。

1.2.4 MTT溶液的配制 準確稱取50.00 mg的MTT溶解于4.5 mL的MSC基礎培養基中，然后再用MSC基礎培養基定容至5.0 mL，分裝后于-20 ℃保存備用。

1.2.5 其他試劑的配制 (1)10%APS的配制。準確稱量1.00 g的APS溶解于8 mL蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至10 mL，分裝后于-20 ℃保存備用。(2)10%SDS的配制。準確稱量10.00 g的SDS溶解于80 mL蒸餾水中，50 ℃加熱溶解，然后用蒸餾水定容至100 mL，于室溫保存備用。(3)30%丙烯酰胺貯液的配制。精確稱取29.00 g的丙烯酰胺和1.00 g的N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，溶解于80 mL蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至100 mL，過濾后避光于4 ℃保存備用。

1.2.6 絲膠蛋白分子量的測定 試驗采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE法)測定絲膠蛋白的相對分子量。將從桑條吐精煉液中提取的HS和LS溶液用純化水稀釋至體積質量濃度為0.5 mg/mL，并與含β-巰基乙醇的蛋白上樣緩沖液充分混合，煮沸3 min離心備用。HS在15%的分離膠體系下進行，LS在20%的分離膠體系下進行。上樣(每孔上樣量為10 μL，共10孔)，在80 V電壓下電泳30 min，120 V電壓下電泳1 h，取出凝膠，固定(甲醇∶冰醋酸=4∶1，100 mL)，用考馬斯亮藍溶液染色4 h以上，染色結束后脫色(甲醇∶冰醋酸=5∶1，100 mL)3～5次，每次間隔40～60 min直到蛋白質條帶清晰可見，與蛋白標準品條帶比對確定絲膠蛋白的相對分子量。

1.2.7 細胞黏附試驗 將HS和LS分別用MSC基礎培養基稀釋至體積質量濃度為0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液為試驗組，以體積質量濃度為100 μg/mL的FN[12-14]為陽性對照組，以PBS為陰性對照組，共6組，每組分別做12個平行。上述各組分別以100 μL加入96孔細胞培養板中，4 ℃過夜，完成包被。將包被過夜的96孔板用PBS洗滌2～3次，然后加入細胞，密度為104個/孔，再加入含體積質量百分比為0.5%的FBS基礎培養基100 μL，在37 ℃下孵育20 min，去除液體，再次用PBS洗滌2～3次，去除未貼壁細胞，加入完全培養基繼續培養4 h。采用MTT比色法檢測細胞的生長情況，具體過程如下：用完全培養基培養4 h后，每孔再加入20 μL體積質量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h。終止培養，小心吸去上清液，加入150 μL/孔的DMSO振蕩5～10 min，使結晶物充分溶解，選擇在490 nm波長下，用酶標儀測其吸光度值，重復測定3次，并以試驗各組及陽性和陰性對照組為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制柱狀圖，對比分析HS和LS在同一體積質量濃度下的細胞黏附活性。

2 結果與分析

2.1 絲膠蛋白相對分子量的確定

通過SDS-PAGE 法測定絲膠蛋白LS和HS的分子質量分布。從圖1可以看出，利用膜過濾技術制備的HS分子量主要分布在31.0～97.4 kD之間，LS分子量分布在7.8～31.0 kD之間。

HS表示高分子量絲膠蛋白，LS表示低分子量絲膠蛋白。圖1 HS(A)和LS(B)的SDS-PAGE法測定的分子質量圖譜

2.2 絲膠蛋白HS和LS的細胞黏附活性

試驗以體積質量濃度為100 μg/mL的FN為陽性對照，以PBS為陰性對照，HS和LS等2種分子量大小的絲膠蛋白在0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL體積質量濃度下均表現出良好的細胞黏附活性，具體如圖2所示。從圖2可以看出,在同一體積質量濃度下經HS包被處理過夜的試驗組對間充質干細胞的黏附活性極顯著高于(P<0.01)LS包被處理過夜的試驗組。試驗結果表明，不同分子量的絲膠蛋白對間充質干細胞的黏附活性產生了重要影響。

柱圖為490 nm波長下的吸光度值。圖2 MTT法檢測經HS和LS包被處理96孔板過夜后對間充質干細胞的黏附活性

3 小結與討論

試驗采用SDS-PAGE法測定利用膜過濾技術從桑條吐精煉液中回收提取的高分子量絲膠蛋白的分子量分布在31.0～97.4 kD之間，低分子量絲膠蛋白的分子量分布在7.8～31.0 kD之間。

絲膠蛋白用于生物醫學材料時，必須要有良好的生物相容性，細胞在相關材料上的黏附活性是評價絲膠蛋白生物相容性的重要指標之一[9-10]。本試驗通過膜過濾技術制備了高分子量和低分子量絲膠蛋白用于探究其做為生物材料構建的可行性，用2種不同分子量的絲膠蛋白包被處理96孔板過夜后，用MTT法檢測其對細胞的黏附活性，試驗結果表明，從桑條吐精煉液中利用膜過濾技術回收的高分子量絲膠蛋白和低分子量絲膠蛋白均表現出良好的細胞黏附活性，且在同一體積質量濃度下高分子量絲膠蛋白各試驗組極顯著高于(P<0.01)低分子量絲膠蛋白各試驗組，這可能與絲膠蛋白的純度有很大的關系，在蠶絲脫膠過程中的各種化學藥劑殘留為主要原因，這也為絲膠蛋白的提純技術提出了更高的要求。本試驗驗證了絲膠蛋白生物相容性對細胞的黏附活性的影響，為其在醫學工程領域的開發提供了理論依據。