液相色譜-串聯質譜法探索淺暗化型家蠶的發生原因

張 彥 張 勇 秦 鳳 石 涼 童曉琪 黃 浩 黃德輝( 安徽省農業科學院蠶桑研究所，安徽合肥 3006; 六安市金安區農產品質量安全中心,安徽六安 37007)

暗化型家蠶自發現以來，就因其全齡期表現黑化表型而備受矚目，特別是其蛾期全身包括蛾翅在內均呈黑褐色，明顯地區別于普通蠶蛾的白色或淡黃色，家蠶育種專家利用這一特點培育出黑白分明的雙親，把家蠶一代雜交種的雜交率提高到99%以上，從而在顯著提高家蠶一代雜交種質量的同時，大幅減少了蠶種場剔除純對、保持雜交率方面的用工[1-4]。安徽省農業科學院蠶桑研究所家蠶育種組工作人員在對暗化型品系580進行選育的過程中，發現了幼蟲期頭、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等發育階段體色均比正常暗化型家蠶著色較淺的群體——淺580。通過觀察統計580與淺580家蠶個體除在著色上有差別以外，在蟲體形態、眠起時間、蟲蛹率等生理方面并沒有差別，并通過對家蠶品系淺580做遺傳調查后發現淺暗化型突變與暗化型突變一樣，相對于普通白蛾表型為隱性遺傳[5]。

進一步研究發現，家蠶淺暗化型突變品系淺580第7天蛹體內暗化突變基因BmiAANAT(mln)與黑色素代謝通路上另一條表達產物同樣具有催化多巴胺功能的基因BmiAANAT2的表達量相對于家蠶暗化型突變品系580均大幅下調，并推測該變化是引起淺580發生的主要原因[5]。為驗證該推測并進一步揭示淺暗化型家蠶的發生機理，增強對家蠶黑色素代謝調控機制的認識，本研究設計了通過利用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)分析580及淺580第8天蛹體內多巴和多巴胺等黑色素前體物質含量變化的試驗。現將有關情況報告如下，供同仁參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試家蠶 暗化型家蠶品系580、淺暗化型家蠶品系淺580，均由安徽省農業科學院蠶桑研究所家蠶育種組培育，在適宜條件下飼養、上蔟、結繭、化蛹，蛹期第8天時，用純水輕柔沖洗，瀝干后于-80 ℃ 儲存、備用。

1.1.2 主要試劑 左旋多巴(色譜純，D9628)、鹽酸多巴胺(色譜純，H8502)、乙腈(色譜純，34851)，均為美國Sigma公司產品；甲酸(色譜純，85174)，美國Thermo公司產品。

1.1.3 主要儀器設備 Agilent1290液相色譜儀、SB-PHENYL色譜柱(2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm)、Agilent 6460 LC/MS 液質聯用儀，均為安捷倫科技(中國)有限公司產品；JK 3200B超聲波清洗器，上海超聲波儀器公司產品；BP211D電子天平，德國賽多利斯公司產品；冷凍干燥器，美國熱電公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 甲酸溶液的配制 稱取0.1 mL甲酸用去離子水溶解并定容至100 mL，配制成體積分數為0.1%的甲酸溶液。

1.2.2 樣品的獲取及提取 取580及淺580第8天的蠶蛹各20頭，分別使用凍干機冷凍干燥，高速粉碎機粉碎并過100目篩。各稱取5.0 mg樣品，加入5.0 mL甲酸、5.0 mL乙腈和40.0 mL純水，渦旋1 min，混勻后15 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。

1.2.3 標準物質溶液的配制 取標準物質儲備液，加水分別配制成濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的標準物質溶液，過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS分析。

1.2.4 液相及質譜條件 流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為乙腈，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣體積為10 μL；霧化器溫度350 ℃，霧化器流速10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，采集方式為多反應監測(MRM)，條件如表1所示。

表1 多反應監測模式(MRM)參數

2 結果與分析

2.1 多巴和多巴胺標準品及樣品的色譜圖

如圖1和圖2所示，圖1-A是多巴標準品的色譜圖，多巴的保留時間為0.89 min；圖1-B是樣品的色譜圖，分析物的保留時間分別出現在0.89 min和1.24 min，對比圖1-A保留時間在0.89 min所示的物質應是多巴。圖2-A和圖2-B所示分別為多巴胺標準品和樣品的色譜圖，所示物質的保留時間均在0.98 min，兩者應為同一物質即多巴胺。

圖1 多巴標準品(A)及樣品(B)的色譜圖

圖2 多巴胺標準品(A)及樣品(B)的色譜圖

2.2 多巴和多巴胺標準品的標準曲線及線性回歸方程

圖3所示為以多巴標準品濃度為X軸和相應檢測值為Y軸制作的標準曲線，計算得線性回歸方程為y=1 337.431 68x+2 085.691 49(r=0.992 63)，在10～200 μg/L范圍內線性關系良好。圖4所示為以多巴胺標準品濃度為X軸和相應檢測值為Y軸制作的標準曲線，計算得線性回歸方程為y=1 652.106 72x+9 033.529 10(r=0.999 85)，在10～200 μg/L范圍內線性關系良好。

圖3 多巴標準曲線

圖4 多巴胺標準曲線

2.3 樣品內多巴和多巴胺的含量

從圖5可以看出：淺580第8天脫水干蠶蛹體內多巴和多巴胺的含量分別為79 955 μg/kg和1 035 μg/kg；580第8天脫水干蠶蛹體內多巴和多巴胺的含量則分別為38 735 μg/kg和3 400 μg/kg。淺580第8天蛹體內的多巴含量是580第8天蛹體內的2倍多，差異極顯著；而淺580第8天蛹體內所含的多巴胺含量卻不到580第8天蛹體內含量的1/3，差異水平也達到了極顯著。淺580與580蛹體內多巴與多巴胺這2種黑色素前體物質含量的顯著差異導致的黑色素含量不同是二者表現出不同程度的黑化表型的直接原因。

圖5 樣品580與淺580第8天蛹體內多巴與多巴胺含量

3 小結與討論

家蠶暗化型突變早在1961年就有了報道，但直到詹帥和代方銀等把BmiAANAT基因確定為暗化突變基因(mln)才解析了其發生的原因，該基因的表達產物為芳烷基乙酰轉移酶，其催化底物是多巴胺[6-7]。多巴胺是家蠶黑色素代謝通路的關鍵物質，是由酪氨酸經酪氨酸羥化酶作用合成多巴再經多巴脫羧酶作用生成的，下游代謝有3條轉化途徑：一是在酶的作用下與β-丙氨酸結合生成N-β-丙酰多巴胺，最后合成黃褐色的色素；二是經芳烷基乙酰轉移酶作用轉化為N-乙酰基多巴胺，最終生成無色或透明的色素；三是在一系列酶的催化下生成深棕色的多巴胺黑色素。BmiAANAT基因發生突變，使第2條途徑受阻就是暗化型家蠶的發生原因[8-11]。2015年LONG等[12]在家蠶中鑒定出了另1條AANAT基因，將其命名為BmiAANAT2，并通過基因敲除技術證實該基因編碼的酶也具有催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能，其表達產物與BmiAANAT編碼的酶相似度高達57%。

MATTHEW等[9]通過克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全長序列和測定其相對表達量分析了2個基因與淺暗化型家蠶形成的關系，克隆和測序結果顯示，家蠶品系580與淺580所含BmiAANAT的突變類型是相同的，突變后的基因堿基序列與以前的報道一致；580與淺580這2個家蠶品系間BmiAANAT2的堿基序列也無差異。分析熒光定量PCR相對表達量結果時發現，580與淺580這2個家蠶品系間BmiAANAT和BmiAANAT2的相對表達量都存在極顯著的差異，且家蠶品系580的2個暗化突變基因的相對表達量均顯著上調。綜合分析，家蠶品系淺580的發生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2堿基序列突變造成的，而與體內這2個基因的相對表達量顯著下降有關；并認為幼蟲期、蛹期末期、蛾期等發育階段淺580品系的個體都表現出比580品系的個體黑化程度更淺的表型特征，是源于體內較低的黑色素含量，結合淺580個體內BmiAANAT、BmiAANAT2的表達量大幅下調，從而推測家蠶品系淺580個體內黑色素的前導物多巴胺含量也應該低于家蠶品系580。

本研究，以暗化型家蠶品系580和淺580的第8天蛹為材料，利用LC-MS/MS分析蛹體內多巴和多巴胺等黑色素前體物質含量變化，結果顯示，淺580第8天蠶蛹內多巴的含量是580第8天蠶蛹的2倍多，而淺580第8天蠶蛹內多巴胺的含量明顯低于580第8天蠶蛹。這一結果不僅驗證了前期的推測，也進一步證明了淺580的淺暗化表型的發生與其體內過低的多巴胺含量直接相關，多巴胺含量的降低通過反饋調節使BmiAANAT、BmiAANAT2的表達量下調的同時也使多巴胺黑色素的生產量下降；但為什么淺580體內高水平含量的多巴不轉化為多巴胺，且也沒有產生大量的多巴黑色素(為黑褐色)進而使淺580表現出深暗化表型的機理，還需更加深入的研究。