家蠶A型咽側(cè)體抑制激素對(duì)白僵菌感染的抑制作用

蘇 韻 吳萬明 林 蘇 趙 澤 王 新 陳潤湞 ,2 李木旺,2 孫 霞,2 張振東,2 郭錫杰,2(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 2200； 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 2200)

家蠶(Bombyxmori)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，是探索昆蟲免疫防御機(jī)制和宿主與病原互作機(jī)制的重要模式生物。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是蠶業(yè)生產(chǎn)上對(duì)家蠶危害最嚴(yán)重的病原真菌之一，但也被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)家蠶感染球孢白僵菌后A型咽側(cè)體抑制激素(A type allatostatin，AST-A)基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，咽側(cè)體抑制激素前激素原(allatostatin preprohormone，AST-P)基因的表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。咽側(cè)體抑制激素是一類具有多種功能的昆蟲神經(jīng)肽，其主要的功能是抑制保幼激素(juvenile hormone，JH)的生物合成，同時(shí)從昆蟲的發(fā)育過程到攝食、免疫行為，都有咽側(cè)體抑制激素參與細(xì)胞、組織間的相互調(diào)節(jié)而使機(jī)體達(dá)到內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。神經(jīng)肽被認(rèn)為是早于神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化的第1個(gè)細(xì)胞間遞質(zhì)，也被認(rèn)為是無脊椎動(dòng)物最早的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在所有動(dòng)物的激素分泌中起著重要調(diào)節(jié)作用[2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，咽側(cè)體抑制激素被細(xì)分為3個(gè)完全不同的肽組：AST-A，最早在太平洋碩蠊(Diplopterapunctata)中發(fā)現(xiàn)[3]，有共同的末端序列Y/FXFGL-NH2；B型咽側(cè)體抑制激素(AST-B)，最早在雙斑蟋蟀(Gryllusbimaculatus)中發(fā)現(xiàn)，它們都有C末端基序WX6W-NH2[4]；C型咽側(cè)體抑制激素(AST-C)，首次在煙草天蛾(Manducasexta)中發(fā)現(xiàn)，有和A型、B型無關(guān)的C末端[5]。結(jié)構(gòu)-活性研究表明，C-末端Y/FXFGL-NH2是AST-A的活性核心區(qū)，這些共同的保守C末端序列Tyr/Phe-Xaa-Phe-Gly-Leu-NH2(Xaa=Ala，Asn，Gly，Ser)是抑制JH生物合成的關(guān)鍵氨基酸殘基[6]。因?yàn)檠蕚?cè)體抑制激素能強(qiáng)烈抑制咽側(cè)體對(duì)保幼激素的生物合成，因此被認(rèn)為是開發(fā)新型昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的潛在候選對(duì)象[7]。

咽側(cè)體抑制激素除了諸如控制覓食行為，減少進(jìn)食和促進(jìn)睡眠，甚至肌肉活性等方面的功能之外，對(duì)昆蟲的免疫也具有調(diào)控功能。早在1993年，就發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)分泌樣細(xì)胞群和神經(jīng)肽免疫反應(yīng)細(xì)胞的存在[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，AST-B可以與螃蟹體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫(neuroendocrine immune，NEI)網(wǎng)絡(luò)受體結(jié)合，并觸發(fā)下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝胰腺的免疫應(yīng)答[9]。昆蟲的促咽側(cè)體素(allatropin)和咽側(cè)體抑制激素等神經(jīng)肽均對(duì)昆蟲的免疫系統(tǒng)和心臟收縮率有調(diào)節(jié)作用[10]。在腸分泌細(xì)胞中，dimm基因控制靶細(xì)胞AST-A等的水平，可以防止昆蟲假單胞菌(Pseudomonasentomophila)感染并調(diào)控抗菌肽的表達(dá)[11]。

本研究克隆獲得家蠶A型咽側(cè)體抑制激素(BmAST-A)基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了BmAST-A蛋白，采用體腔注射試驗(yàn)和RNA干涉方法，揭示BmAST-A蛋白在家蠶抵御球孢白僵菌感染過程中的作用，為探明家蠶抵御球孢白僵菌感染的分子機(jī)制和研發(fā)家蠶白僵病的防控措施提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蠶品種 本研究使用的家蠶品系為p50，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存提供。在溫度25 ℃和相對(duì)濕度90%的條件下，以新鮮桑葉飼養(yǎng)至5齡起蠶進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 供試白僵菌 試驗(yàn)用球孢白僵菌HN6菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶病理研究室從白僵病蠶分離保存。

1.1.3 主要試劑 酵母提取物、蛋白胨、氯化鈉(分析純)、瓊脂粉、PBS緩沖液、Trizol、TaKaRa Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、熒光定量試劑盒等試劑，均為寶生物TaKaRa(大連)生物有限公司產(chǎn)品；RNApure超純總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、蛋白透析袋(8 kD，寬度50 mm，容積8.0 mL/cm)、鹽酸胍、一抗(His-Tag 鼠 mAb)、二抗(羊抗鼠IgG HRP)等試劑，均為生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、卡那霉素鈉，均為Amresco公司產(chǎn)品；BCA蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒，為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，為愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 PTC-100TC PCR儀，為MJ Research公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)、臺(tái)式低溫離心機(jī)、Biophotometer分光光度計(jì)，均為Eppendorf公司產(chǎn)品；7300熒光定量PCR儀，為ABI公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LB培養(yǎng)基配制 稱量5 g酵母提取物、10 g蛋白胨、10 g氯化鈉，用800 mL去離子水?dāng)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜? L，高溫高壓滅菌后即為LB液體培養(yǎng)基。在上述LB液體培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉，用去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝蠖ㄈ葜? L，滅菌后冷卻至適宜溫度加入氨芐青霉素或卡那霉素至終濃度50 μg/mL，混勻立即倒平板，即為含有相應(yīng)抗生素的LB固體平板培養(yǎng)基。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建 采用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取5齡家蠶頭部組織的總RNA，并采用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)家蠶BmAST-A基因核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001043571.1)，采用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(上游引物為5′-CTAGCTAGCATGCTGTCGGCTTGTCTCCCATTG-3′，下游引物為5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCGTCGATGTAGTTCT

CAC-3′，其中下劃線部分為BamH I和NotI 酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Ex Taq酶在20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35次循環(huán)后，再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD 19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10感受態(tài)細(xì)胞并用含有氨芐青霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽性克隆。測(cè)序驗(yàn)證正確的BmAST-A核苷酸序列連接入表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Arctic Express(DE3)表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞，并用含卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽性克隆。通過BamH I和NotI雙酶切及測(cè)序?qū)χ亟M表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-AST-A進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 BmAST-A蛋白的表達(dá)與純化 將成功構(gòu)建的表達(dá)菌株接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、37 ℃培養(yǎng)到OD600≈0.6至0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6 h。收集菌體，冰上進(jìn)行超聲破碎3次，每次50個(gè)循環(huán)(超聲強(qiáng)度250 W，超聲破碎5 s，間隔5 s)，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素溶解。用質(zhì)量百分比濃度為12%的預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot(一抗：His-Tag 鼠 mAb；二抗：羊抗鼠IgG HRP)檢測(cè)重組蛋白。

使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白，收集咪唑洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot檢測(cè)純化效果。將目的蛋白洗脫液，依次以尿素濃度為6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L和0 mol/L 的PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)溶液進(jìn)行透析，對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性后的目的蛋白離心超濾濃縮后，采用BCA蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)重組BmAST-A蛋白的濃度。

1.2.4 重組BmAST-A蛋白家蠶體腔注射試驗(yàn) 將p50品系5齡起蠶浸泡于107孢子/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液中接種感染。感染后分為2組，每組10頭，設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)組在感染6 h后體腔注射0.5 mg/mL 的BmAST-A蛋白5 μL，陰性對(duì)照組在感染6 h后注射PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)5 μL，另設(shè)空白對(duì)照組不做任何處理。3組家蠶幼蟲在正常條件下飼養(yǎng)，每隔2 h觀察記錄發(fā)病及死亡情況，至所有幼蟲全部死亡。所得數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistic 25.0軟件進(jìn)行回歸分析，計(jì)算存活率和半數(shù)致死時(shí)間(LT50)。

1.2.5BmAST-A基因表達(dá)的RNA干涉 由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成BmAST-A基因的干涉RNA(siRNA，正義鏈5′-GGUCUCGCCCGUACUUGUUTT-3′，反義鏈5′-AACAAGUACGGGCGAGACC

TT-3′)和陰性對(duì)照(NC，正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。將5齡起蠶浸泡于球孢白僵菌分生孢子懸浮液中接種感染，分為2組，每組30頭，設(shè)3個(gè)重復(fù)。感染6 h后，試驗(yàn)組體腔注射濃度為90 ng/μL 的siRNA 5 μL，陰性對(duì)照組體腔注射相同濃度的NC 5 μL，另設(shè)空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。3組家蠶幼蟲在正常條件下飼養(yǎng)，每隔2 h觀察記錄發(fā)病及死亡情況，至所有幼蟲全部死亡。同時(shí)，qRT-PCR 檢測(cè)BmAST-A基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)病及死亡頭數(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算存活率和半數(shù)致死時(shí)間。

1.2.6 qRT-PCR 解剖收集家蠶的脂肪組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量試劑盒按照操作步驟在ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)BmAST-A基因的表達(dá)，以BmGAPDH基因作為內(nèi)參基因，所有樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。使用2-△△Ct方法[12]計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmAST-A基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

BmAST-A基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001043571.1)開放閱讀框?yàn)?15 bp，編碼204個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)結(jié)果顯示該蛋白的第1～17氨基酸為信號(hào)肽。因此，以家蠶5齡幼蟲頭部組織cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增去除信號(hào)肽并加上起始密碼子 ATG的567 bp序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析表明，反應(yīng)產(chǎn)物顯示條帶位于600 bp附近(圖1)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

M—DNA Marker，1—BmAST-A 基因編碼序列PCR產(chǎn)物。圖1 BmAST-A ORF的PCR擴(kuò)增

回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pMD19-T載體，經(jīng)測(cè)序表明擴(kuò)增獲得的BmAST-A基因核苷酸序列正確。然后通過BamH I和NotI酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增片段連接到表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a(+)-BmAST-A，酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示5 369 bp的pET-28a質(zhì)粒條帶和567 bp 的目的基因條帶(圖2)，同時(shí)，測(cè)序結(jié)果與原序列一致，說明原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BmAST-A構(gòu)建成功。

M—DNA Marker，1—pET-28a(+)-BmAST-A。圖2 pET-28a(+)-BmAST-A雙酶切鑒定

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將成功構(gòu)建的pET-28a(+)-BmAST-A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DE3表達(dá)菌株中，在終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)BmAST-A蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和western blot檢測(cè)顯示，出現(xiàn)約25 kD的蛋白條帶(圖3)，與預(yù)測(cè)結(jié)果22 kD大致相符。同時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存于培養(yǎng)物沉淀中。而轉(zhuǎn)化pET-28a(+)質(zhì)粒的空白對(duì)照組無相應(yīng)蛋白條帶出現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明BmAST-A蛋白得到成功表達(dá)。

A.表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定，B.表達(dá)產(chǎn)物western blot鑒定。M：蛋白質(zhì)分子量，1：pET-28a(+)-BmAST-A轉(zhuǎn)化菌裂解后的沉淀，2：pET-28a(+)-BmAST-A轉(zhuǎn)化菌裂解后的上清，3：pET-28a(+)空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌裂解后的沉淀，4：pET-28a(+)空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌裂解后的上清。圖3 BmAST-A的表達(dá)鑒定

從BmAST-A的純化鑒定電冰圖(圖4)可以看出，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過鎳柱純化和梯度復(fù)性后，得到的蛋白條帶和預(yù)測(cè)蛋白大小符合，表明通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出重組目的蛋白。以BCA蛋白濃度試劑盒制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物蛋白濃度為0.5 mg/mL。

A.純化蛋白SDS-PAGE鑒定，B.純化蛋白western blot鑒定。 M：蛋白質(zhì)分子量，1：純化后的重組BmAST-A蛋白。圖4 BmAST-A的純化鑒定

2.3 BmAST-A蛋白對(duì)球孢白僵菌感染的抑制作用

Kaplan-Meier曲線表明注射重組蛋白BmAST-A的 試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組家蠶幼蟲的存活率。圖5 重組BmAST-A蛋白對(duì)家蠶白僵病發(fā)病的抑制作用

經(jīng)多次體外抑菌圈試驗(yàn)，均未能檢測(cè)到BmAST-A蛋白對(duì)球孢白僵菌分生孢子發(fā)芽與生長的抑制作用。但我們前期的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果表明，在球孢白僵菌感染的家蠶幼蟲BmAST-A基因的表達(dá)被明顯上調(diào)，表明BmAST-A基因編碼的蛋白質(zhì)可能參與家蠶對(duì)球孢白僵菌感染的抵御作用。為了解析BmAST-A蛋白在家蠶抵御球孢白僵菌感染過程中的作用，對(duì)接種感染球孢白僵菌的5齡家蠶進(jìn)行了BmAST-A蛋白的體腔注射試驗(yàn)。感染前期家蠶正常食桑與生長，無明顯癥狀，感染72 h后家蠶體壁上出現(xiàn)白僵病的典型油斑狀癥狀，并且出現(xiàn)吐液等癥狀；取渾濁的血淋巴鏡檢能觀察到球孢白僵菌短菌絲，死亡后的家蠶尸體出現(xiàn)僵硬并在2～3 d后體壁上長出白色菌絲，逐漸被白色菌絲和分生孢子覆蓋形成白僵蠶，而空白對(duì)照組的家蠶正常生長直至結(jié)繭。但從圖5可以看出，與陰性對(duì)照組相比，注射BmAST-A蛋白的試驗(yàn)組家蠶首見死亡的時(shí)間推遲了24.0 h，半數(shù)致死時(shí)間推遲了32.9 h。表明BmAST-A蛋白可能通過調(diào)控家蠶的免疫功能抑制家蠶白僵病的發(fā)病進(jìn)程。

2.4 BmAST-A基因的RNA干擾

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BmAST-A蛋白對(duì)家蠶白僵病發(fā)病進(jìn)程的抑制作用，對(duì)接種感染了球孢白僵菌的家蠶5齡幼蟲采用RNA干擾方法沉默BmAST-A基因的表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，注射BmAST-A基因的siRNA后，家蠶BmAST-A基因的轉(zhuǎn)錄水平在24 h和48 h顯著降低，在12 h和36 h的轉(zhuǎn)錄水平也有降低，但未達(dá)到顯著水平(圖6)，表明BmAST-A基因的表達(dá)受到抑制。同時(shí)，注射了BmAST-A基因的siRNA的試驗(yàn)組家蠶幼蟲的首見死亡時(shí)間比對(duì)照組提早了7.0 h，半數(shù)致死時(shí)間提早了16.8 h，全部死亡時(shí)間提早了15.0 h(圖7)，進(jìn)一步證明BmAST-A蛋白可能通過調(diào)控家蠶的免疫能力延緩球孢白僵菌對(duì)家蠶的致病進(jìn)程。

*表示差異顯著，**表示差異極顯著。圖6 感染球孢白僵菌的家蠶注射siRNA后BmAST-A基因的表達(dá)變化

Kaplan-Meier曲線表明注射靶向BmAST-A基因的 siRNA試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組家蠶幼蟲的存活率。圖7 siRNA干涉BmAST-A基因表達(dá)對(duì)家蠶白僵病發(fā)病的影響

3 小結(jié)與討論

球孢白僵菌是研究和應(yīng)用最多的病原真菌之一，能夠引起家蠶等經(jīng)濟(jì)昆蟲白僵病的發(fā)生，常給蠶桑產(chǎn)業(yè)等經(jīng)濟(jì)昆蟲產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。但球孢白僵菌因其寄主范圍廣泛、致病性和適應(yīng)性較強(qiáng)以及制備和應(yīng)用操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最好的生物防治菌種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。因此，研究家蠶抵御球孢白僵菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制對(duì)于研發(fā)家蠶白僵病的有效防控措施和提高球孢白僵菌對(duì)農(nóng)林害蟲的防治效果具有重要意義。包括A型咽側(cè)體抑制激素在內(nèi)的咽側(cè)體抑制激素神經(jīng)肽家族在果蠅的覓食、進(jìn)食、新陳代謝和睡眠等行為中發(fā)揮著神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和激素的作用[13]。肽類激素在昆蟲繁殖、飛行、滯育、感染以及免疫等過程中也參與脂質(zhì)代謝。直接或間接參與昆蟲脂質(zhì)代謝的主要肽類激素是AST-A[7，14]。黑腹果蠅被細(xì)菌感染后，傷害性神經(jīng)元釋放的AST-C作為免疫抑制肽發(fā)揮作用，減弱免疫反應(yīng)，從而防止細(xì)胞過早死亡[15]。有研究認(rèn)為，AST-C是一種由傷害感受器或果蠅血細(xì)胞釋放的免疫抑制物質(zhì)，抑制免疫缺陷(immune deficicncy，IMD)信號(hào)通路，以防止免疫病理或減少微生物刺激后不必要的代謝成本[15]。而在對(duì)AST-A進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AST-A與AST-C具有相同的受體結(jié)合區(qū)域[16]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶感染球孢白僵菌后，AST-A基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，咽側(cè)體抑制激素前激素原基因的表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，暗示AST-A在家蠶應(yīng)對(duì)球孢白僵菌侵染的過程中可能發(fā)揮重要的生理生化作用和抗真菌免疫調(diào)控作用。

本研究在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)了家蠶BmAST-A蛋白，家蠶體內(nèi)試驗(yàn)表明，表達(dá)的重組BmAST-A蛋白對(duì)家蠶白僵病的發(fā)生具有一定的抑制作用。將重組BmAST-A蛋白注射到染病家蠶體腔中，家蠶的發(fā)病時(shí)間較陰性對(duì)照組(注射等量的PBS緩沖液)緩慢，半數(shù)致死時(shí)間延遲了32.9 h。而在抑菌圈試驗(yàn)中，并未見重組BmAST-A蛋白對(duì)球孢白僵菌的抑菌效果。表明這類神經(jīng)肽在家蠶體內(nèi)可能參與了某個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或免疫調(diào)控通路而發(fā)揮作用。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，咽側(cè)體抑制激素受體(ASTR)與幾種動(dòng)物受體相關(guān)，并通過Gi/o G蛋白連接以抑制環(huán)腺苷(cAMP)并激活G-蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀通道(inward-rectifier potassium channel，GIRK)[17]。AST-A還通過其在脂肪酸釋放激素(adipokinetic hormones,AKH)和胰島素樣肽(insulin-like peptides,ILP)產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)的甘丙肽樣受體“DAR2”(果蠅Allatostatin受體2)調(diào)節(jié)脂肪酸釋放激素和胰島素樣肽進(jìn)而干擾昆蟲免疫[18]，例如脂肪酸釋放激素在病原感染后升高，而脂肪酸釋放激素的升高可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[19]。雖然神經(jīng)肽在免疫反應(yīng)中的作用仍然是一個(gè)相對(duì)未知的領(lǐng)域，但有研究表明，神經(jīng)肽參與了這些過程。例如，蟑螂的AST-A是由血細(xì)胞產(chǎn)生，表明AST-A在免疫反應(yīng)中起作用[20]。在我們的RNA干擾試驗(yàn)中，將靶向BmAST-A的siRNA注射到感染球孢白僵菌的家蠶體腔內(nèi)，抑制了BmAST-A的表達(dá)，家蠶的發(fā)病時(shí)間相較于陰性對(duì)照組(注射相同濃度的NC)提早，半數(shù)致死時(shí)間提前了16.8 h。在BACHTEL等[15]的實(shí)驗(yàn)中也通過敲除C型咽側(cè)體抑制激素受體2(AstC-R2)的方法，檢測(cè)AstC-R2缺陷突變體中的免疫信號(hào)，證明了AstC-R2特異性地抑制免疫缺陷途徑。

總之，我們的研究結(jié)果表明，BmAST-A蛋白對(duì)家蠶白僵病的發(fā)生具有一定的抑制作用，延緩了家蠶白僵病的發(fā)病過程。推測(cè)其機(jī)理可能是通過調(diào)控家蠶的相關(guān)免疫通路和免疫效應(yīng)因子的表達(dá)等來實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)理有待將來進(jìn)一步深入研究。