HPLC-MS/MS測定小兒消食片中檳榔堿的含量

劉愛明，徐玲玲，王迎春，王 芳，逯海燕，劉小雨，戚 敏，陳 凱

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟南 250101）

小兒消食片收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由炒雞內(nèi)金、山楂、六神曲（炒）、炒麥芽、檳榔、陳皮六味中藥經(jīng)多步工藝制成。功能主治為消食化滯，健脾和胃。用于食滯腸胃所致積滯，癥見食少、便秘、脘腹脹滿、面黃肌瘦[1]。該藥入口酸甜可口，具有使小兒易于接受的優(yōu)點[2]，臨床用于治療小兒消化類疾病，是家庭常備藥品[3-4]。檳榔堿的藥理活性主要為刺激交感神經(jīng)，通過細胞外Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)M膽堿受體興奮，使胃腸平滑肌張力升高[5-6]，增強腸蠕動，增加消化液分泌，使食欲增加，起到消食作用[7]。但過量的檳榔堿可引起毒性[8-10]。目前檳榔堿的含量測定方法主要有酸堿滴定法[1]、薄層掃描法、毛細管電泳法[11]、高效液相色譜（HPLC）法[12-13]等。由于小兒消食片成分復(fù)雜，酸堿滴定法只能測定總生物堿的含量；薄層掃描法、毛細管電泳法操作繁復(fù)、準確度低；HPLC法準確度高，但樣品前處理步驟繁瑣，耗時長，方法靈敏度較低。因此這些方法都存在一定的局限性。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，本文提供了一種重現(xiàn)性好、靈敏度高、分析速度快、樣品前處理簡單的小兒消食片中檳榔堿含量的檢測方法，可用于檳榔堿的含量測定與小兒消食片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260-6430液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（LC-MS/MS，美國安捷倫），包括G1379B型脫氣機，G1312B型二元輸液泵，G1367E型自動進樣器，G1330B型控溫模塊，G1316A型柱溫箱，6430 MS/MS系統(tǒng)及Mass hunter數(shù)據(jù)采集軟件；FE20型pH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；AUW-120D型電子分析天平（日本島津）；ME-204E型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Milli-Q超純水機[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LED加熱磁力攪拌器（美國巴羅克）。

1.2 試藥

小兒消食片（每片重0.3 g，由生產(chǎn)單位提供）；氫溴酸檳榔堿（批號：111684-200401，中國食品藥品檢定研究院）；地西泮（批號：171225-201304，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，Merck）；乙酸銨（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher scientific）；甲酸（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher scientific）；0.9 %氯化鈉注射液，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：采用Agilent 1260高效液相儀，色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18柱（4.6 mm×75 mm，2.7 μm）；流動相為10 mmol/L乙酸銨溶液（用甲酸調(diào)pH至5.2）（A）與甲醇（B），洗脫梯度：0～0.5 min，15 %B；0.5～2.1 min，15 %B→90 %B；2.1～3.0 min，90 % B；3.1～6 min，15 %B。樣品檢測時間：6 min；流速：1.0 ml/min；進樣量：5 μl；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用Agilent 6430三重四極桿質(zhì)譜儀，電噴霧正離子源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）分析模式。干燥氣：N2；干燥氣流速：10 L/min，干燥氣壓力：45 psi，干燥氣溫度：350 ℃，毛細管電壓：4000 V。定量離子對：檳榔堿：[M+H]+m/z156.1/44.2，碎片電壓：100 V，碰撞能量：13 eV；內(nèi)標地西泮：[M+H]+m/z285.1/193.1，碎片電壓：150 V，碰撞能量：30 eV。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標儲備溶液的制備 精密稱取地西泮10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得10 μg/ml內(nèi)標儲備液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取氫溴酸檳榔堿對照品15 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得檳榔堿含量約為10 μg/ml的對照品儲備液。取0.5，2，5，10，20 ml對照品儲備液，加入2.2.1項下內(nèi)標儲備液1 ml，用甲醇稀釋，分別配制不同濃度的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品若干片，研細后取約0.6 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，加水定容至刻度，置磁力攪拌器上，850 r/min攪拌5 min，即得濃度為24 mg/ml的供試品混懸液。精密移取供試品混懸液3 ml，置入EP管，超聲30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾。分別精密量取續(xù)濾液500 μl、甲醇490 μl及2.2.1項下內(nèi)標儲備液10 μl，置入EP管，混勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取處方中除檳榔外的中藥材適量，按處方比例及制備工藝同法制片，并按2.2.3項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取2.2.4項下陰性對照溶液，按2.1項條件進樣檢測，得陰性對照溶液圖譜（見圖1）；取2.2.2項下對照品儲備液200 μl、甲醇790 μl及2.2.1項下內(nèi)標儲備液10 μl，置入EP管，混勻，按2.1項條件進樣檢測，得對照品溶液（含內(nèi)標）圖譜（見圖2）；取2.2.3項下供試品溶液按2.1項條件進樣檢測，得供試品溶液圖譜（見圖3）。結(jié)果表明，供試品與對照品出峰位置一致，內(nèi)標和陰性對照均不干擾待測物的準確定量。

圖1 陰性對照溶液圖譜

圖2 對照品溶液（含內(nèi)標）圖譜

圖3 供試品溶液圖譜

2.4 線性關(guān)系的考察

取2.2.2項下對照品儲備液0.5，2，5，10，20 ml，分別置入100 ml量瓶，加入2.2.1項下內(nèi)標儲備液1 ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為50，200，500，1000，2000 ng/ml的對照品溶液。按2.1項下HPLC-MS/MS條件測定，以檳榔堿的濃度（按氫溴酸檳榔堿濃度/1.5214計）為橫坐標X，檳榔堿與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標Y，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/X2）進行回歸運算，求得的直線方程即為標準曲線。回歸方程為Y=0.173930X+0.001489，r=0.9979（n=5）。結(jié)果表明，檳榔堿在50～2000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取2.2.2項下對照品儲備液200 μl、甲醇790 μl及2.2.1項下內(nèi)標儲備液10 μl，置入EP管，混勻，得對照品溶液（含內(nèi)標）。按2.1項下HPLC-MS/MS條件測定，連續(xù)進樣6次，計算色譜圖中檳榔堿和內(nèi)標峰面積比值的RSD為1.6 %，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取批號為1601016的樣品6份，分別按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下HPLC-MS/MS條件測定，計算6份樣品中檳榔堿含量的RSD為1.2 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取2.2.3項下同一供試品溶液，室溫下放置4 h，分別在0，2，4 h時取樣，按2.1項下HPLC-MS/MS條件測定，記錄峰面積，計算色譜圖中檳榔堿和內(nèi)標峰面積比值的RSD為1.3 %，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批（批號：1601016）供試品，研細后精密稱定，每份約0.6 g，3份為一組，分別加入一定量的2.2.2項下對照品貯備液，3組樣品中檳榔堿的含量與加入檳榔堿的含量比值分別為1:1.5，1:1，1:0.5，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項HPLC-MS/MS條件檢測，測得檳榔堿的平均加樣回收率為100.91 %，RSD為1.30 %（n=9），說明該方法準確度良好，見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果（n=9）

2.9 含量測定

取3個不同批次的小兒消食片，分別按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下HPLC-MS/MS條件測定檳榔堿含量，結(jié)果見表2。

表2 供試品含量測定結(jié)果

3 討論

通過查閱文獻[11-13]，選擇先用水制備供試品混懸液，再用甲醇提取，提取方式選擇超聲30 min。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸溶液等不同流動相系統(tǒng)的分離效果，最終確定色譜條件：流動相A：10 mmol/l乙酸銨溶液（用甲酸調(diào)pH至5.2）；流動相B：甲醇。洗脫方式：梯度洗脫；洗脫梯度程序如下：0～0.5 min，15 %B；0.5～2.1 min，15 %B→90 %B；2.1～3.0 min，90 %B；3.1～6 min，15 %B。該方法操作簡單，操作時間短，專屬性強、靈敏度高、穩(wěn)定、可靠，可用于檳榔堿的含量測定及小兒消食片質(zhì)量控制。