HPLC測定利奈唑胺原料藥中3個降解雜質

彭相君，于麗萍，路 易

（1. 日照市第二人民醫院，山東 日照 276807；2. 山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 273400）

利奈唑胺（linezolid）為全合成的噁唑烷酮類抗菌藥，其結構式見圖1。利奈唑胺對革蘭陽性球菌特別是多重耐藥的革蘭陽性球菌有良好的抗菌活性，對葡萄球菌、鏈球菌敏感[1-3]。由于利奈唑胺具有獨特的作用位點和方式，不易與其他抗菌藥產生交叉耐藥性，在臨床上用于革蘭陽性菌引起的肺炎、皮膚軟組織感染、腦膜炎、心內膜炎、菌血癥、骨髓炎和外科手術感染等的治療[4-5]。

利奈唑胺分子結構中存在酯鍵和酰胺鍵，在貯存過程中可能產生降解，有文獻報道[6-10]，利奈唑胺在堿性環境下主要降解產物為雜質I與雜質II；酸性環境下主要降解產物為雜質III。其降解過程見圖1。本研究建立梯度洗脫方法，同時測定利奈唑胺中雜質I、雜質II和雜質III，采用對照品外標法計算3種雜質的含量，定量準確，為利奈唑胺的雜質控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（含四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）；Mettler Toledo 205電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

利奈唑胺對照品（純度：99.7 %，批號：DZ170201），雜質I對照品（純度：99.5 %，批號：DZ170207），雜質II對照品（純度：99.8 %，批號：DZ170208），雜質III對照品（純度：99.5 %，批號：DZ170209），利奈唑胺原料藥（批號：190301，190302，190303，臨沂萊博科技公司）；乙腈為色譜純，三氟乙酸為優級純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A相為0.1 %三氟乙酸乙腈溶液，B相為0.1 %三氟乙酸水溶液，線性梯度洗脫，程序見表1；流速1.0 ml/min；檢測波長 254 nm；柱溫30 ℃；進樣量 10 μl。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品貯備液 分別精密稱取利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III對照品各約100 mg，置100 ml量瓶中，用溶劑（流動相A:流動相B=10:90）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 μg/ml的對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密量取上述對照品貯備液各1.0 ml，置同一100 ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為10 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.3 系統適用性試驗溶液 精密量取對照品貯備液各適量，用溶劑定量稀釋制成含利奈唑胺約1000 μg/ml，含雜質I、雜質II和雜質III均約1 μg/ml的溶液，作為系統適用性試驗溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取利奈唑胺原料藥約100 mg，置100 ml量瓶中，用溶劑溶解并定容，即得濃度為1000 μg/ml的供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取2.2項下溶劑、系統適用性試驗溶液和供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，見圖2。色譜圖中各色譜峰均分度良好，各色譜峰的理論板數均在5000以上。

圖2 專屬性色譜圖

2.4 專屬性試驗

取利奈唑胺原料藥，分別進行下列試驗：（1）酸降解試驗：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的鹽酸溶液5 ml，室溫放置5 h，精密加入1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml中和，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（2）堿降解試驗：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液5 ml，80 ℃水浴加熱10 min，放冷，精密加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml中和，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（3）氧化降解試驗：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入3 %過氧化氫3 ml，搖勻，室溫放置5 h，強烈振搖至無氣泡產生，再加入溶劑稀釋至刻度，搖勻；（4）高溫降解試驗：取利奈唑胺原料藥適量，置稱量瓶中，置烘箱中，于130 ℃加熱3 h，取出，放冷，精密稱取25 mg，置25 ml量瓶中，加入溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻；（5）光照降解試驗：取利奈唑胺原料藥約25 mg，置25 ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，倒入石英吸收皿中，置澄明度檢測儀下，調節光照強度為4000 lx，放置24 h。取以上降解試驗溶液，按2.1項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖3。結果顯示，利奈唑胺在酸、堿、氧化條件下有關物質的含量均增加，在高溫和光照條件下較穩定。其中酸性與堿性條件影響較顯著，在酸性條件下水解，主要產生雜質III；在堿性條件下，主要生成雜質I和雜質II。各降解物色譜峰與主峰間均能良好分離。

圖3 降解試驗色譜圖

2.5 線性關系試驗

精密量取利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III對照品貯備溶液適量，用溶劑分別稀釋制得濃度為0.1，0.5，1，5，10 μg/ml的系列溶液，分別進樣，記錄色譜圖。以對照品溶液濃度c（μg/ml）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程。利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III的標準曲線方程和相關系數（r）結果見表2。結果表明，利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III的線性關系良好。

2.6 定量限與檢測限

取利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III對照品貯備溶液，用溶劑逐步稀釋，按2.1項下色譜條件測定，以S/N=10求得利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III的定量限（LOQ），以S/N=3求得利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III的檢測限（LOD），結果見表2。

表2 利奈唑胺及各雜質的線性試驗、LOD和LOQ結果

2.7 精密度試驗

取2.5項下對照品溶液（濃度為1 μg/ml），重復進樣6次，計算利奈唑胺、雜質I、雜質II和雜質III各色譜峰峰面積的RSD分別為0.47 %，0.23 %，0.38 %和0.32 %。表明儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗

精密稱取利奈唑胺原料藥100 mg，按2.2.4項下方法配制供試品溶液，于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h后進樣，記錄色譜圖，結果雜質I、雜質II和雜質III峰面積的RSD分別為1.36 %，1.49 %和1.65 %。表明樣品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

2.9 重復性試驗

精密稱取利奈唑胺原料藥100 mg，共6份，按2.2.4項下方法配制供試品溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖，計算雜質I、雜質II和雜質III的含量，結果雜質I、雜質II和雜質III含量的RSD分別為1.75 %，1.51 %和1.58 %。表明該方法重復性良好。

2.10 回收率試驗

精密稱取已測得各雜質含量的利奈唑胺原料藥（批號：190301）約50 mg，共9份，各置100 ml量瓶中，分別加入雜質I、雜質II和雜質III對照品貯備溶液適量，配制成約相當于各雜質濃度水平50 %，100 %和150 %的溶液，各3份，作為加樣回收率試驗溶液，分別進樣，計算雜質I、雜質II和雜質III的加樣回收率，結果見表3。雜質I、雜質II和雜質III的平均回收率分別為97.36 %，96.76 %和95.54 %，RSD分別為1.62 %，1.22 %和1.82 %。

表3 回收率試驗結果（n=9）

2.11 樣品測定

取利奈唑胺原料藥3批，按2.2.4項下方法分別配制供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，采用對照品外標法分別計算雜質I、雜質II和雜質III的含量，結果見表4。

表4 雜質I、雜質II和雜質III測定結果（n=2）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本文采用梯度洗脫，在流動相中加入0.1 %三氟乙酸，各色譜峰分離良好，峰形尖銳且對稱，柱效較高。采用二極管陣列檢測器，各物質在254 nm波長處均有較強的紫外吸收，因此選擇254 nm作為檢測波長。

3.2 溶劑的選擇

對照品溶液與供試品溶液的配制溶劑均采用初始梯度時流動相的比例，即流動相A:流動相B=10:90。用初始梯度流動相溶解樣品，可避免各色譜峰前延或托尾的現象，使峰形正態，積分準確。

3.3 方法耐用性考察

參照《中國藥典》2020年版中對方法耐用性的要求[11]，對2.1項下色譜條件進行微小調整，通過改變柱溫（25 ℃、35 ℃及室溫）、流速（0.8 ml/min及1.2 ml/min）、檢測波長（252 nm，256 nm）與色譜柱品牌型號等試驗條件，考察該方法的耐用性。結果顯示以上色譜條件變化對分離效果影響不大。

利奈唑胺在存放過程中可能產生降解產物，通過查閱文獻及對利奈唑胺原料藥在酸、堿、氧化、高溫和強光照射條件下的破壞試驗，雜質I、雜質II和雜質III是利奈唑胺的主要降解雜質。本文建立HPLC方法，對利奈唑胺中3種主要降解雜質進行測定，為利奈唑胺質量控制提供參考。