泊洛沙姆作為溫度敏感型凝膠基質的安全性評價

徐雨生，廖川江，段美娟＊

（1. 湖南農業大學，湖南 長沙 410128；2. 大理大學 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室 藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南 大理 671000）

溫度敏感型原位凝膠（thermosensitive in situ gel）是目前研究較為廣泛的敏感型原位凝膠之一[1-3]。其優點在于以原位凝膠為載體攜帶藥物可直接患部給藥，提高藥物生物利用度，組織親和力強，給藥后可親和給藥部位，并迅速發生相變形成半固體凝膠，高度親水性的三維網格結構可將藥物束縛其中，延長藥物在用藥部位的滯留時間，具有良好的緩釋作用[4-5]；組織相容性好，對機體刺激性很小，使用方便有效[6]；適用范圍廣，局部作用藥物、全身作用藥物、大分子藥物、親水性藥物和疏水性藥物等多數藥物均可以原位凝膠為載體[7]。

泊洛沙姆（poloxamer）作為一類食品添加劑和藥物制劑的輔料（賦形劑）在化工、生物工程、醫藥等領域有著廣泛應用[8]。泊洛沙姆是一種高分子非離子型表面活性劑，其毒性低，生物相容性好，且具有低溫時為流動液體，體溫下成凝膠狀的特性，是理想的藥物控釋材料[2]。目前國內尚未見有關其毒性研究的報道。本研究對泊洛沙姆作為婦科疾病局部給藥的溫度敏感型凝膠基質的安全性進行了初步評價，為臨床應用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EL-104型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；MilliQ Plus超級純水儀（廣州艾科普公司）；ASP-300S型自動脫水機（德國Leica公司）；BM-VIII型生物組織包埋機（孝感市宏業醫用儀器有限公司）；RM2245型手動切片機（德國Leisa公司）；YT-7FB型生物組織攤烤片機（湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；BI-2000型醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 試劑

泊洛沙姆P 4 0 7（批號：W P E H 5 4 0 B，BASF）；泊洛沙姆P188（批號：WPYH570B ，BASF）；生理鹽水（批號：15102404，昆明市宇斯藥業有限責任公司）。

1.3 實驗動物

健康SPF級昆明種小鼠222只，雌雄各半，體重18～22 g；健康SPF級SD大鼠34只，雌性未孕，體重220～260 g，均由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物許可證：SCXK（湘）2014-0011，飼養于大理大學實驗動物中心的 IVC 系統。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 泊洛沙姆P407溶液制備 稱取適量泊洛沙姆P407固體，加入三蒸水，配制成濃度為30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %（w/w）的泊洛沙姆P407溶液。

2.1.2 泊洛沙姆P188溶液制備 稱取適量泊洛沙姆P188固體，加入三蒸水，配制成濃度為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %（w/w）的泊洛沙姆P188溶液。

2.1.3 泊洛沙姆P407/P188混合溶液制備 按質量比2.5:1，稱取適量泊洛沙姆P407、P188固體，加入三蒸水，配制成濃度為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %（w/w）的泊洛沙姆P407/P188混合溶液。以40.00 %的泊洛沙姆P407/P188混合溶液作為空白凝膠。

2.2 經口急性毒性試驗

2.2.1 半數致死劑量（LD50）的測定 選取昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機分成4組，每組10只，分別按20 ml/kg劑量灌胃給予生理鹽水、30.00 %泊洛沙姆P407溶液、40 %泊洛沙姆P188溶液、40 %泊洛沙姆P407/P188混合溶液[9]。試驗小鼠于給藥前12 h和給藥后4 h內禁食，飲水自由，給藥后逐日觀察，連續14 d，參照《藥物毒理學實驗方法與技術》[10]，觀察小鼠用藥后有無中毒表現、出現時間、持續時間和恢復時間，死亡時間，并記錄小鼠外觀、行為、排泄物、死亡數和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重。

2.2.2 經口最大耐受量（MTD）的測定 選取昆明種小鼠32只，隨機分成2組，每組16只，雄雌各半，第一組按最大可給藥體積（40 ml/kg）[9]灌胃給予空白凝膠，第二組給予等容積的生理鹽水。試驗小鼠于給藥前12 h和末次給藥后4 h內禁食，飲水自由，試驗當天首次給藥后間隔6 h再次給藥，逐日觀察，連續14 d，參照《藥物毒理學實驗方法與技術》[10]，觀察小鼠用藥后有無中毒表現、出現時間、持續時間及恢復時間，死亡時間，并記錄小鼠行為、排泄物，死亡數和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重。

2.3 腹腔注射急性毒性試驗

選取昆明種小鼠150只，雄雌各半，隨機分為15組，每組10只，分別按20 ml/kg劑量，腹腔注射[9,11]方式給予泊洛沙姆P407溶液（濃度分別為30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %）、泊洛沙姆P188溶液（濃度分別為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %）、泊洛沙姆P407/P188混合溶液（濃度分別為40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %）。試驗小鼠給藥前12 h和末次給藥后4 h內禁食，飲水自由，給藥后逐日觀察，連續14 d，參照《藥物毒理學實驗方法與技術》[10]，觀察小鼠用藥后有無中毒表現、出現時間、持續時間及恢復時間，死亡時間，并記錄小鼠外觀、行為、排泄物、死亡數和死亡情況。隔天記錄小鼠的體重、飲水量和采食量。

2.4 陰道給藥急性毒性試驗

選取雌性未孕大鼠18只，按體重隨機分為3組，每組6只。按0.01 ml/10 g劑量陰道給藥，第一組12 h內給予空白凝膠4次，第二組12 h內給予空白凝膠6次[11]，第三組為空白對照組，不給藥。試驗大鼠給藥前12 h和末次給藥后4 h內禁食，飲水自由，給藥后參照《藥物毒理學實驗方法與技術》[10]，逐日觀察，連續7 d，并記錄中毒反應、死亡數和死亡情況，隔天記錄大鼠的體重。

2.5 陰道黏膜刺激性試驗

選取雌性未孕大鼠16只，按體重隨機分成兩組，分別為空白凝膠組和空白對照組，每組8只。空白對照組不給藥，空白凝膠組按0.01 ml/10 g劑量大鼠陰道給藥[1,3]，連續14 d，給藥期間觀察大鼠中毒情況及陰道局部的變化，記錄中毒反應、陰道病變情況、大鼠死亡數和死亡情況。隔天記錄大鼠的體重，并于給藥后第8天和第15天，各組分別隨機處死2只大鼠，取出陰道組織，10 %福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，進行病理組織學檢查[12-13]。試驗期間若有死亡大鼠應及時解剖，觀察其臟器組織形態、顏色有無異常，有明顯病變者需取材進行病理組織學檢查。根據《中藥藥理研究方法學》“中藥陰道制劑毒性試驗方法”對陰道黏膜刺激反應的評定要求分別對肉眼和病理組織學觀察進行評分[14]。

3 數據處理與統計分析

4 結果

4.1 小鼠經口急性毒性試驗結果

小鼠灌胃給予泊洛沙姆P407溶液的LD50>6.00 g/kg；小鼠灌胃給予泊洛沙姆P188溶液的LD50>8.00 g/kg；小鼠灌胃給予泊洛沙姆P407/P188混合溶液的LD50>8.00 g/kg；各組小鼠在給藥后立即出現豎毛、蜷縮、扎堆的現象，1 h后基本恢復正常，4 h后陸續出現稀便的現象，24 h后基本恢復正常。14 d的觀察期內均未出現嚴重的不良反應或死亡，體重隨試驗時間的延長而增加。觀察期內，每只小鼠投食量為4 g/d，所有受試小鼠都能吃完當天的飼料。14 d后處死部分小鼠，解剖無可見臟器的病變。

小鼠灌胃給予空白凝膠的MTD>16 g/kg。NS對照組小鼠在給藥后14 d的觀察期內均未出現明顯的異常、不良反應或死亡，體重也隨實驗時間的延長而增加。空白凝膠組小鼠在首次給藥后 4 h 陸續出現稀便的現象，第二次給藥后4 h小鼠的大便呈黏稠的液體狀，末次給藥結束后24 h小鼠逐漸恢復稀便，48 h后小鼠大便恢復正常。空白凝膠組小鼠于首次給藥后立即出現豎毛、蜷縮、扎堆的現象，1 h后恢復活躍狀態；第二次給藥后大部分小鼠有干嘔的現象，小鼠有豎毛、安靜、扎堆的表現，4 h后投食，所有小鼠進食表現基本恢復正常。

4.2 小鼠腹腔注射急性毒性試驗結果

結果顯示，小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407溶液的LD50為3.66 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P188溶液的LD50為7.74 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407/P188溶液的LD50為5.62 g/kg；小鼠腹腔注射不同基質后在14 d的觀察期內出現不同程度的毒性反應：泊洛沙姆P407組：藥物注射后小鼠活動、狀態正常，20 min后部分小鼠活動緩慢、狀態變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，24 h后開始有小鼠死亡，最高劑量組死亡小鼠眼睛流淚，解剖發現腹腔內有積液，肉眼觀察肝臟色澤暗淡，腸系膜血管充盈，其余劑量組死亡小鼠解剖發現肝臟色澤暗淡，其余組織和臟器無異常；泊洛沙姆P188組：藥物注射后小鼠活動、狀態正常，20 min后部分小鼠活動緩慢、狀態變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，24 h后部分小鼠逐漸恢復，48 h后最高劑量組開始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖發現肝臟色澤暗淡，其余組織、臟器無異常；泊洛沙姆P407/P188組：藥物注射后小鼠活動、狀態正常，20 min后部分小鼠活動緩慢、狀態變差、豎毛、喜扎堆、飲食量正常，72 h后最高劑量組開始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖發現肝臟色澤暗淡，其余組織、臟器無異常，結果見表1。

表1 小鼠腹腔注射泊洛沙姆的急性毒性試驗LD50測定結果（n=10）

結果表明，泊洛沙姆以腹腔注射方式給藥會有一定的毒性。該產品主要為外用，該結果可為其他用藥途徑毒性評價提供一定的參考。

4.3 大鼠陰道給藥急性毒性試驗結果

空白凝膠12 h內分別4次或6次給藥，在給藥后7 d的觀察期內，所有大鼠進食正常，均未出現任何不良反應和死亡，體重也隨著試驗的延長而增加。根據試驗結果，空白凝膠組大鼠陰道給藥的MTD>2.40 g/kg。

4.4 大鼠陰道黏膜刺激性試驗結果

所有大鼠在14 d的給藥期內進食正常，未出現任何不良反應和死亡，體重也隨試驗的延長而增加，給藥期間大鼠陰道外周未見明顯的紅斑、水腫和膿性分泌物；連續給藥14 d內，空白凝膠對大鼠的陰道黏膜無明顯的刺激性；空白凝膠給藥7 d和14 d的大鼠陰道組織，在40倍顯微鏡下可見組織結構正常，層次分明，少量淋巴細胞和中性粒細胞分散浸潤，與正常大鼠相比黏膜層及黏膜下層未見明顯變化，結果見表2、3及圖1。

圖1 各組大鼠陰道組織病理切片（HE，×40）

表2 陰道黏膜刺激性試驗大鼠外陰肉眼評分（n=8）

表3 陰道黏膜刺激性試驗大鼠陰道病理組織學評分（n=2）

5 結論

此產品擬專為治療婦科疾病研制，故局部毒性和刺激性實驗結果更具有實際意義。由泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P188組成的溫敏型空白凝膠基質經小鼠口服、陰道黏膜給藥基本無毒。泊洛沙姆可作為對人體基本無毒性、無局部刺激性的治療婦科疾病局部給藥的溫敏型凝膠基質。