自微乳化給藥系統促進鹵泛群經淋巴轉運的研究

譚亞男，尹宗寧

（1. 四川省食品檢驗研究院，四川 成都 611731；2. 四川大學華西藥學院 靶向藥物與釋藥系統教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

鹵泛群[1-2]（halofantrine，HF）是菲甲醇的衍生物，分子式為C26H30Cl2F3NO，1988年5月在法國首次獲準上市，主要用于治療惡性瘧和間日瘧。已上市口服制劑一般為鹵泛群的鹽酸鹽，水溶性差，生物利用度低，屬于生物藥劑學分類（BCS）中第II類藥物，其次鹵泛群的lgP值為8.716，脂溶性良好，符合自微乳給藥系統（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）模型藥物的要求。

SMEDDS是由表面活性劑、助表面活性劑、油相形成的固體或液體載藥體系[3-4]。主要優點在于：將藥物分散在微米級別的乳滴中，提高藥物溶解度和溶出速率，促進藥物吸收，減少最低給藥量，降低副作用；不改變藥物的分子形態，保持原有構型，避免了可能出現的晶型改變；藥物被包裹在O/W型微乳內相的油相中，避免與水相接觸，增強藥物的穩定性。自微乳的輔料也能間接起到抑制胃腸道酶代謝及藥物外排的作用，如吐溫-80具有抑制P-糖蛋白（P-gp）外排的作用[5]。本研究以清醒的二插管大鼠為動物模型，建立了高效液相色譜（HPLC）檢測淋巴中HF的方法，測定不同比例處方的生物利用度，以為HF口服制劑的開發提供研究思路與基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司） ；Nicomp 380 ZLS Zeta電位/粒度分析儀（美國PSS粒度儀公司）；QT-1旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸鹵泛群（HFT，武漢恩宇生物科技有限公司）；亞油酸乙酯（江蘇奧奇海洋生物有限公司）；非諾貝特（FB，徐州恩華藥業股份有限公司）；辛伐他汀（SV，上海市食品藥品檢驗所）；花生油（美國Sigma-Aldrich公司）；吐溫80（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（HPLC級，美國Tedia公司）；乙腈（HPLC級，美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性（體重280～320 g），購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

2 方法與結果

2.1 鹵泛群（HF）的制備

稱取約2 g HFT，依次加入100 ml無水乙醇，0.25 g氫氧化鈉，100 ml水及50 ml二氯甲烷，振搖2 min后靜置分層，收集下層液體。上層液體再用25 ml二氯甲烷萃取一次，合并兩次萃取得到的下層溶液。加入過量無水硫酸鎂干燥，放置過夜。溶液經濾紙過濾后旋蒸至干，瓶中油狀物即為HF。

2.2 鹵泛群自微乳化給藥系統（HF-SMEDDS）的制備

根據文獻[6-7]和前期研究基礎，選擇亞油酸乙酯為油相，吐溫80為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑，制備HF-SMEDDS。由于HF較黏稠稱量不便，可將HF定量加入吐溫80中，超聲溶解，得到便于稱量和計算的含藥吐溫80。依次稱取相應重量的亞油酸乙酯、乙醇和吐溫80（由含藥吐溫80和空白吐溫80兩部分組成，含藥吐溫80質量相同，根據處方不同，稱取相應空白吐溫80）。渦旋混合均勻后，得到淡黃色澄清油狀液體，即得HF-SMEDDS，避光密封備用。

2.3 HF-SMEDDS處方設計

為考察油相和混合乳化劑（吐溫80和無水乙醇）的比例（A）及乳化劑與助乳化劑的比例（B）對HF淋巴轉運的影響，依據星點設計原則[8]，設計了B值為1:1～2:1，A值為2/8（0.25）～4/6（0.667），極值為3:7的9個處方。表1為二因素的星點設計因素及水平表。按星點設計效應面優化得到9個處方，具體成分組成見表 2。

表1 因素及水平

2.4 HF-SMEDDS處方粒徑測定

吸取HF-SMEDDS樣品10 μl于離心管中，加入1～5 ml不等的超純水使其自微乳化，用NICOMP 380 ZLS Zeta電位/粒度分析儀測定粒徑，結果見表2。

表2 處方設計及制得HF-SMEDDS粒徑

2.5 HF-SMEDDS中HF含量測定

精確稱取HF-SMEDDS 0.1 g，按中國藥典2020年版溶出度測定中第三法小杯法[9]的有關操作說明，將HF-SMEDDS裝入普通膠囊中，每個處方平行操作3次，考察其體外釋藥情況。取樣時間點分別為5，10，15，30，45 min。樣品加入過量甲醇破乳，采用HPLC測定HF含量。色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），加Alltech 充填式預柱（1.0 mm×20 mm）；流動相為乙腈-水（含 0.2 %十二烷基硫酸鈉和0.2 %冰醋酸）（80:20）；檢測波長：258 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl。該條件下，HF的線性回歸方程為A=1.4950C-0.2124，r=0.9972，在25～5000 ng/ml范圍內線性關系良好。低、中、高3個濃度（1，25，100 μg/ml）的平均回收率分別為93.00 %，98.24 %，97.32 %，精密度RSD分別為2.60 %，1.88 %，2.89 %（n=3），符合樣品分析要求。

2.6 清醒二插管大鼠模型的建立

2.6.1 頸靜脈插管[10]SD大鼠經腹腔注射2 %戊巴比妥鈉溶液（0.24 ml/100 g）麻醉，剃去頸部毛發，剪開約2 cm皮膚，依次鈍性分離肌肉和脂肪組織，分離頸靜脈，將兩根手術線穿過血管，先結扎遠心端處血管，防止血液回流，再將血管近心端手術線打一活結，在兩根手術線間的血管段剪小口，插入靜脈管至右心房時，系上近心端預留的活結，固定插管。注入生理鹽水，將插管內殘余的血液推回心房，防止血液凝固。在大鼠頸后皮膚開口，插入引導管，經皮至鎖骨處與靜脈插管聯結。

2.6.2 淋巴插管[11]術前30 min，大鼠灌胃花生油2 ml，使淋巴管充盈，淋巴液由透明變為乳白色。麻醉大鼠后，剃去腹部體毛，剪開腹部淋巴總管對應處皮膚。用手術鑷穿引形成皮下通道，將淋巴插管通過2.6.1項所述大鼠頸后皮膚開口經皮下至腹部皮膚開口，可使淋巴插管埋入大鼠皮膚固定，繼續剪開腹部肌肉，挪動內臟，暴露乳白色腸系膜淋巴總管。在淋巴總管上剪開小口，插入淋巴插管，在剪口處用醫用生物膠封閉并固定，縫合傷口，淋巴插管尾端部分插入大鼠背負的玻璃小瓶中，收集淋巴液。

2.6.3 術后護理 將淋巴插管與頸靜脈插管連接，淋巴液可通過頸靜脈重新進入體液循環。大鼠清醒后可恢復行動能力，主動飲水、進食。

2.7 給藥方案及生物樣品的采集處理

2.7.1 動物分組及給藥 隨機選取成功建模后的大鼠30只，每個處方組3只，作為受試組，分別灌胃給予表2中9組處方HF-SMEDDS 0.2 g（含HF 4 mg）。給藥后1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，30 h通過頸靜脈插管抽取0.3 ml血液，加入肝素鈉作為抗凝劑，5000 r/min 離心10 min，取血漿待檢測。同時間點收集大鼠背部玻璃小瓶內所有的淋巴液，加入適量抗凝劑混勻，作為淋巴樣品待檢測。3只作為參比組，通過頸靜脈插管給予含HF脂肪乳（將HF加入20 ml脂肪乳注射液）0.3 ml。參比組給藥后5，10，20，60 min及2，4，6，8，10，24，30 h通過頸靜脈插管抽取血樣。

2.7.2 淋巴樣品預處理及方法學考察 取淋巴液100 μl，置入10 ml離心管中，加入內標50 μl，乙腈5 ml，渦旋10 min，靜置，12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl，按2.5項下色譜條件進樣分析。HF的淋巴樣品線性回歸方程為：A=0.0187C+0.0014，r=0.9999，在2～250 μg/ml范圍內線性關系良好。方法的定量限為25 ng/ml，檢測限為10 ng/ml。方法回收率>98 %，日內、日間精密度（n=3）RSD分別為2.05 %，2.31 %，符合要求。

2.7.3 淋巴轉運結果 按2.7.2項下方法處理淋巴樣品，根據測得的HF濃度，結合相應時間段收集的淋巴液量，計算得到HF淋巴轉運累積量占口服給藥量的百分比值，結果見圖1。各處方HF的淋巴轉運基本在12 h內完成。處方8轉運比例最高（19.64 %），處方1最低（2.25 %）。

圖1 各處方淋巴轉運累積百分比

2.7.4 血液樣品預處理及方法學考察 取血液樣品100 μl，加入內標辛伐他丁（40 μg/ml）溶液100 μl及乙腈100 μl，渦旋2 min混勻，12 000 r/min離心10 min。取上層清液轉移至C8固相萃取小柱進行分離提取。萃取小柱預先用2 ml甲醇，2 ml去離子水活化。上清過柱后用1 ml去離子水洗滌2次，再用0.75 ml 15 %甲醇水（v/v）洗滌2次。最后用1 ml 乙醚洗脫兩次，收集洗脫液。40 ℃氮吹至近干，100 μl乙腈復溶，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl進樣檢測。血液樣品線性回歸方程為：A=1.059C-113.72，r=0.9968，在31.25～2000 ng/ml范圍內線性關系良好。該方法的定量限為25 ng/ml，檢測限為10 ng/ml。方法回收率>90 %，日內、日間精密度RSD（n=3）分別為1.61 %，2.99 %，符合要求。

2.7.5 各處方HF血液轉運結果及絕對生物利用度 按2.7.4 項下方法，測定9組處方口服給藥后不同時間點血液樣品中HF的濃度，得到HF血液轉運量見圖2，其中處方2血樣中未檢測到藥物。

圖2 各處方口服給藥后藥時曲線

按2.7.4項下方法，測定參比組血樣中HF的含量，得到HF靜脈給藥不同時間點的藥時曲線，見圖 3。以參比組靜脈給藥量為對照，計算不同處方口服給藥后的血液中藥物含量與總給藥量的比值，結果見表4。處方2血藥濃度最低，未達到檢出濃度。處方7血液中藥物量與總給藥量比值最高（13.13 %），其次為處方6（12.67 %）。

圖3 靜脈給藥藥時曲線

表4 口服給藥后血液中藥物含量與總藥量的比值

3 討論

SMEDDS能增加高脂溶性藥物的溶解度，口服后迅速乳化分散，有效提高藥物的吸收速率，同時通過增加藥物的淋巴轉運吸收提高藥物的生物利用度。本研究中采用二插管動物模型進行藥動學實驗，分別測定淋巴液和血液中的藥物含量，可直觀地比較不同處方口服給藥后淋巴轉運的差異及生物利用度的不同。

動物模型的建立和生物樣品的凈化是實驗的主要難點。已報道的二插管建模動物包括豬、狗、羊、大鼠等。動物體型越小，動物經費成本越低，但手術操作難度隨之增加。本研究中采用清醒的SD大鼠做為實驗模型，該模型術后恢復時間短，不影響動物的自主飲食活動，相較麻醉動物模型，實驗數據更貼近正常動物口服給藥后的藥物代謝情況。實驗周期內通過頸靜脈插管和腸系膜淋巴插管，可隨時方便地收集血樣和淋巴液樣品。但由于動物存在的個體差異和術后的恢復情況不同，所得藥動學數據雖然可反映不同處方間的差異，但平行性較差，后續研究可通過增加實驗個體數量改善這一問題。

通過腸系膜插管收集的淋巴樣品，呈乳糜狀，含大量的脂肪和蛋白質，雜質較少，乙腈提取操作中需注意渦旋提取的時間，我們比較了1，3，5，10 min不同時間的提取效率，發現渦旋10 min可提取完全。

血液樣品藥物濃度低，雜質多。根據藥物的lgP值大小選擇了C8固相萃取小柱，能有效完成對藥物的富集和提取。

9組處方粒徑范圍從20～336 nm不等，包含了微乳劑和乳劑。粒徑最小的微乳劑淋巴轉運量最高，粒徑最大的微乳劑淋巴轉運量相對較低，但并非最低。分析實驗結果，可發現微乳劑粒徑大小與藥物淋巴轉運量有一定的聯系。可能和藥物吸收時酶解過程有關，粒徑小的相對更易被酶解成脂肪酸和甘油單酯，更易于淋巴吸收。但僅從粒徑大小無法完全預測淋巴轉運量的高低。這表明還有其他因素共同影響藥物淋巴吸收的環節，或者粒徑的影響作用只在一定的范圍內表現明顯。

脂溶性藥物經淋巴轉運是其口服吸收的重要途徑，本研究中微乳制劑處方的淋巴轉運藥物累積量最高可達給藥劑量的19.6 %，對比最少的淋巴轉運累積量只有2.2 %，說明通過改進制劑處方增加HF的淋巴轉運量可有效提高藥物生物利用度，為HF口服制劑研發提供了一定研究思路與基礎。