越橘提取物中花色苷及游離花青素的測定

毛 丹，馮 睿，程益清，胡 青，季 申

（上海市食品藥品檢驗所 國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，上海 201203）

越橘 （Vaccinium myrtillus），是一類生有漿果的多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹種[1]，為杜鵑花科越橘屬植物[2-4]。該屬植物全世界約有300多種，我國約有60余種。越橘主要生長于歐洲、俄羅斯、北美和阿爾卑斯山海拔 1500～2000 m處，其中歐洲越橘（Vaccinium myrtillusL.）因富含花色苷，具有較強的抗氧化能力，作為保健食品原料已被消費者廣泛認可[5]。越橘提取物是以歐洲越橘的新鮮果實為原料經加工而制成的提取物[6]，其功效顯著、應用范圍廣、副作用低，近年已廣泛應用于保健食品與藥品中[7]。

越橘提取物主要含花色苷活性成分，另外還含多糖、果膠、單寧等成分[8]?；ㄉ帐怯苫ㄇ嗨嘏c糖結合而成的一類物質的統稱，因其基本骨架結構（圖1）與2-苯色原酮結構十分相似，故花色苷類化合物也統稱為黃酮類化合物。花青素是2-苯基苯并吡喃陽離子的多羥基和甲基衍生物，已有研究表明，越橘提取物中花青素主要為錦葵素、飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素5種[9]。因花青素中存在共軛雙鍵，能吸收可見光而呈現一定的顏色。其化學結構中黃烊鹽陽離子缺乏電子，游離的花青素極不穩定，越橘提取物中花青素主要為糖苷形式，所結合的糖主要是葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。本研究測定了越橘提取物中游離花青素及花色苷的含量，以期達到工藝及質量控制的目的。

圖1 花色苷基本骨架結構

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫），配有紫外-可見光檢測器，ChemStation色譜工作站；Sartorius電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司）；矢車菊素（歐洲藥典對照品）；越橘提取物樣品（批號：Q20200903-1，Q20200903-2，Q20200903-3，Q20200903-4，Q20200903-5，Q20200903-6，Q20200903-7，Q20200903-8，Q20200903-9，Q20200903-10，浙江天草生物科技股份有限公司）；甲醇，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 游離花青素的測定

2.1.1 色譜條件 安捷倫Zorbax Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：甲酸-水（8.5:91.5，v/v），流動相B：乙腈-甲醇-甲酸-水（22.5:22.5:8.5:41.5，v/v/v/v），按表1進行梯度洗脫；流速1.0 ml/min，檢測波長535 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。理論板數按矢車菊素計應不低于5000，見圖2。

表1 梯度洗脫程序

圖2 HPLC圖譜

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素對照品（精確至0.01 mg），加2 %鹽酸甲醇溶液制成每1 ml含0.25 mg的溶液。精密量取2 ml上述溶液于100 ml量瓶中，加10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 稱取試樣125 mg（精確至0.1 mg），置100 ml量瓶中，加2 %鹽酸甲醇溶液25 ml，超聲使溶解，再用10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 線性關系考察 精密吸取矢車菊素對照品溶液（4.75 μg/ml）1，2，5，10 μl，矢車菊素對照品溶液（47.52 μg/ml）2，5，10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。回歸曲線方程為Y=5.2407X+4.0747，r=1.0000。結果表明，矢車菊素在4.75～475.24 ng范圍內，進樣量與峰面積線性關系均良好。

2.1.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，4 ℃時分別于0，4，12，18，28 h進樣分析，記錄峰面積，計算RSD為0.7 %。表明供試品溶液保持其溫度為4 ℃時在0～28 h內基本穩定。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取矢車菊素對照品溶液（4.75 μg/ml）10 μl，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD為1.2 %。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 稱取同一樣品6份，按2.1.2.2項方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，測定矢車菊素的含量，計算RSD為0.7 %。表明方法的重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品，一式9份，以3份為一組，分別加入矢車菊素對照品溶液（濃度為475.24 μg/ml）適量，再按2.1.2.2項方法平行操作，進樣分析，測定各自含量并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=9）

2.1.8 定量限與檢出限 將矢車菊素對照品溶液（4.75 μg/ml）逐級稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，直至信噪比為10:1和3:1，對應濃度即分別為定量限和檢出限。游離花青素的定量限（以矢車菊素計）為5.0 ng；檢出限（以矢車菊素計）為1.5 ng。

2.1.9 樣品測定 取樣品，一式2份，按2.1.2.2項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，另取2.1.2.1項下對照品溶液，分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各10 μl，采用外標法計算校正因子進行測定，平均測定結果見表2

表2 樣品中矢車菊素含量測定結果

2.2 花色苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 同2.1.1項下色譜條件。理論板數按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計應不低于5000，見圖1。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品（精確至0.01 mg），加2 %鹽酸甲醇溶液制成每1 ml含0.25 mg的溶液。精密量取2 ml上述溶液于10 ml量瓶中，加10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 同2.1.2.2項下方法。

2.2.3 線性關系考察 精密吸取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液（51.03 μg/ml）1，2，5，10 μl，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液（510.32 μg/ml）2，5，10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。回歸曲線方程為Y=2.3399X+8.331，r=1.0000。結果表明，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在51.03～5103.24 ng范圍內，進樣量與峰面積線性關系均良好。

2.2.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，4 ℃下分別于0，4，12，18，28 h進樣分析，記錄峰面積，計算RSD為0.3 %。表明供試品溶液保持其溫度為4 ℃時在0～28 h內基本穩定。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液（51.03 μg/ml）10 μl，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD為0.2 %。表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 稱取同一樣品6份，按2.1.2.2項方法制成供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，測定矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，計算RSD為0.3 %。表明方法的重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品，一式9份，以3份為一組，分別加入矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液（濃度為1.2758 mg/ml）適量，再按2.1.2.2項方法平行操作，進樣分析，測定各自含量并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n=9）

2.2.8 樣品測定 取樣品，一式2份，按2.1.2.2項下方法制備供試品溶液，另取2.2.2.1項下對照品溶液，分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各10 μl，采用外標法計算校正因子進行測定，平均測定結果見表4。

表4 樣品中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量測定結果

3 討論

3.1 背景

越橘提取物是以歐洲越橘（Va c c i n i u m myrtillusL.）的新鮮冷凍果實為原料經提取加工而成的提取物，主要含花色苷活性成分。越橘提取物在歐美日等發達國家市場很大，是歐洲藥典（EP）、美國藥典（USP）及英國藥典（BP）中收錄品種。我國醫藥保健品進出口商會參考EP和USP，并結合國內越橘提取物的特殊情況，制訂了越橘提取物國際商務標準，用于指導越橘提取物的出口質量控制。但越橘并不是傳統的中藥材，中國藥典中未收錄，也無相關的國家食品原料標準收錄。因此，為保障國家外貿經濟運行的安全和我國人民群眾的食品衛生安全，加強標準建設，促進與國際標準對接，建立符合我國國情的越橘提取物國家質量標準具有重要的現實意義。

3.2 越橘提取物制備工藝

越橘提取物中主要活性成分花色苷為水溶性物質，易溶于甲醇、乙醇、水或它們所組成的混合溶液，不溶于石油醚、乙醚等非極性溶劑。提取花色苷的方法主要有熱水提取法、醇提法、超臨界流體萃取等。其純化方法也有多種，如紙層析法、毛細管電泳法及較為經典的柱層析法等。

USP、EP和BP中越橘提取物提取采用醇提或水提，純化可采用離子交換層析法。同時對我國越橘提取物的部分生產企業進行了調研，結果表明，目前國內在越橘提取物工業化生產中多采用醇提或水提法，而純化方法則多采用大孔樹脂精制方式。本實驗收集的越橘提取物樣品均采用水提取大孔樹脂精制的制備工藝。

3.3 物質基礎研究與分析

采用液相色譜-高分辨質譜對越橘原料和越橘提取物進行了物質基礎研究，結果用于指導標志性成分項目的建立。分別采用正離子及負離子模式對越橘對照提取物溶液及兩份供試品溶液掃描，結果其均在正離子模式下色譜峰信息量較多，故最終選擇正離子模式掃描。

根據越橘對照提取物品質證書中所標示的各花色苷或花青素色譜峰的精確分子量、保留時間及二級碎片確證，對比分析越橘原料及越橘提取物供試品溶液，結果越橘提取物中檢測到15種花色苷成分及5種游離花青素成分共20種化合物，而越橘原料中則僅檢測到15種花色苷成分。

越橘中花青素少以游離態的形式出現，常與葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等通過糖苷鍵形成花色苷。而越橘提取物主要保健功效為抗氧化、保護視力，起作用的活性成分為花色苷，故將15種花色苷設定為其標志性成分項。另由越橘提取加工制成的越橘提取物在工藝制備或貯存中會有降解現象，故設定游離花青素作為理化指標項進行控制。

3.4 色譜柱和柱溫的選擇

本研究對比了Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為目標物的預選分離柱，同時比較了3個不同柱溫（30，25，20 ℃）。結果表明，采用色譜柱Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫30 ℃、色譜柱Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫25 ℃、色譜柱Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫30 ℃，花色苷及游離花青素各目標峰分離效果差別不大，均能滿足檢測要求。實驗室可根據具體情況擇優選取色譜柱及柱溫。

3.5 流動相的選擇及洗脫方式的確定

本研究參考歐洲藥典（EP 10.0）中越橘提取物的含量測定項下流動相的選擇及洗脫方式，對于洗脫方式也嘗試了調整水相及有機相的不同比例，發現調整比例后花色苷及游離花青素各目標峰的分離效果均不及原洗脫方式，故最終確定流動相為A：甲酸+水（8.5:91.5，v/v），B：乙腈+甲醇+甲酸+水（22.5:22.5:8.5:41.5，v/v/v/v），洗脫方式同2.1.1項。

3.6 進樣溶液溫度的選擇

本研究考察了供試品溶液的穩定性，發現常溫放置1 h的供試品溶液就會出現花色苷成分含量降低，游離花青素含量增加的現象，故選擇冷藏（4 ℃）供試品溶液，24 h時內各花色苷峰峰面積及游離花青素峰峰面積均基本穩定。

本研究建立了HPLC法同時測定越橘提取物中花色苷類成分及游離花青素的含量，該方法簡便可行，精密度良好，準確度高，可有效控制越橘提取物的質量。