全因子試驗設計優化他克莫司納米混懸滴眼液的制備工藝

李大偉，薛 松，陳倩倩，祝美華，毛楷凡，劉正平＊

（1. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101；2. 山東福瑞達醫藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

他克莫司（tacrolimus）是一種大環內酯類新型免疫抑制劑，從筑波鏈霉菌中分離得到[1]，是與環孢霉素類似但更為強效的免疫抑制劑，其抑制T細胞的作用是環孢素A的10～100倍[2]。近年，他克莫司在眼部疾病中的應用受到越來越多的重視，臨床上已廣泛應用于春季角結膜炎[3-5]、難治性過敏性結膜炎[6-7]、自身免疫性結膜炎[8-9]、角膜移植術后免疫排斥反應[10-12]等，取得了較好的治療效果。

他克莫司溶解性差，幾乎不溶于水，因此生物利用度低，嚴重影響藥效。納米混懸液是以表面活性劑為穩定劑，將藥物顆粒分散在水中，通過自組裝技術或破碎技術制備的一種亞微膠體分散系統，粒徑一般在10～1000 nm[13]。與傳統意義上的基質骨架型納米體系相比，納米混懸液不需要載體材料，通過表面活性劑的穩定作用，將納米級藥物粒子分散在水中形成穩定的體系。納米混懸液有以下優勢：粒徑小、比表面積大，與生物膜有較強的黏附、滲透作用，不易被清除，能提高生物利用度[14-15]。

本研究首先采用溶劑-反溶劑法制備他克莫司納米微粒混懸液，然后通過離心沉淀法去除有機溶劑，加入穩定劑、pH調節劑、防腐劑、滲透壓調節劑等制成中值粒徑（D50）＜0.3 μm，沉降體積比＞0.9，可保持貯存穩定性的納米混懸滴眼液，確定并優化了粒度適宜、穩定性良好的無菌他克莫司納米混懸液的制備工藝。

在進行個稅遞延保險額度調整的過程中，該額度不應該是一成不變的，應該隨著社會經濟發展情況、物價、城市經濟發展情況等因素來針對性的進行調整，同時政策調整過程中也應該與保險機構、行業協會進行充分溝通，必要時通過社會調研來了解個稅遞延保險發展的實際需求，使定額的調整更加科學，提升客戶滿意度的同時也不會破壞社會的穩定發展。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RW 20 digital攪拌器（美國IKA公司）；Sorvall BIOS A離心機（美國賽默飛公司）；Mastersizer 2000激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

式中，可見頻率步進雷達脈沖組回波信號混頻、采樣后可視為一組離散Chirp信號。因此，目標高分辨距離像的運動補償問題可以轉化為Chirp信號參數估計問題。對式(10)結果進行MDCFT處理，得

1.2 試藥

綜合類實驗室兼具上述兩種或兩種以上功能，如藥劑學(化學與工學)、生藥學(生物學與化學)、生物醫學工程(生物學與放射性)等，需依據具體情況尋找和制定防控點。

他克莫司（福建科瑞藥業有限公司，批號：170615，含量：99.8 %）；聚乙烯醇（江西阿爾法高科藥業有限公司，批號：160922，含量：99.5 %）；苯扎氯銨[泰柯棕化（張家港）有限公司，批號：20170127，含量99.5 %]；氯化鈉（河北華晨藥業有限公司，批號：160619，含量：99.9 %）；磷酸二氫鈉（AR；國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170218，含量：99.0 %）；磷酸氫二鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170218，含量：99.0 %）；無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170218，含量：99.7 %）。

2 方法與結果

2.1 他克莫司納米混懸滴眼液的制備

2.1.1 他克莫司納米微粒的制備 將他克莫司1.00 g溶解于4 ml無水乙醇中，加10 %（w/v）苯扎氯銨水溶液4 ml，攪拌均勻；經0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）濾膜過濾，制得他克莫司溶液；在無菌條件下，將他克莫司溶液在高速攪拌（1500 r/min）下加入滅菌注射用水160 ml中，析出他克莫司納米微粒，繼續攪拌6 h，在無菌條件下，將上述溶液離心（10 000 r/min）10 min，收集固體，加入160 ml 注射用水，使固體微粒懸浮，再次離心（10 000 r/min）10 min，收集固體，制得他克莫司納米微粒。

2.2.2 試驗數據采集及分析 由Minitab 18版軟件生成三中心全因子試驗表，按設計進行試驗。采用馬爾文2000粒度儀測定粒徑，分散相選擇水，分散相折射率選擇1.330，粒子折射率選擇1.620，泵速設置為2000 r/min。測定結果見表2。

2.2.1 全因子試驗設計 按L19（24）全因子設計表進行試驗設計，考察藥物-溶劑比、溶劑-反溶劑比、攪拌速度、攪拌時間對他克莫司納米混懸液粒徑的影響。

通過軟件分析了主效應和二階交互效應對粒徑的影響，通過Pareto圖可見攪拌速度和藥物-溶劑比這2個因素顯著影響他克莫司納米微粒的粒徑，見圖1。對影響粒徑的因素進行方差分析也可看出攪拌速度和藥物-溶劑比可顯著影響粒徑，其P值均小于0.05。

2.2 他克莫司納米微粒制備工藝優化

他克莫司納米微粒制備工藝是制備他克莫司納米混懸滴眼液的關鍵工藝，將影響混懸滴眼液粒度，進而影響其吸收速率和程度。研究中先后采用球磨法、高壓均質法、氣流粉碎法和溶劑-反溶劑法等制備納米微粒，考察其粒徑，最終選擇采用溶劑-反溶劑法制備他克莫司納米微粒。在此基礎上，采用全因子試驗設計進一步對他克莫司納米微粒制備工藝進行優化研究。

2.1.3 他克莫司納米混懸滴眼液的制備 在無菌條件下，將他克莫司納米微粒加入輔料溶液中，攪拌均勻，加注射用水至1000 ml，即得他克莫司納米混懸滴眼液。

表1 他克莫司納米混懸液制備工藝全因子試驗設計

2.1.2 輔料溶液的制備 將透明質酸1.20 g在攪拌下加入900 ml注射用水中，攪拌2 h以上使溶脹完全；在攪拌下加入聚乙烯醇7.00 g，繼續攪拌至完全溶解；加入10 %苯扎氯銨溶液1.00 g，攪拌均勻；加入氯化鈉8.50 g、磷酸氫二鈉0.05 g、磷酸二氫鈉0.76 g，繼續攪拌溶解，加磷酸和5 mol/L氫氧化鈉溶液適量調節pH值至5.0，經0.45 μm聚醚砜濾膜過濾后，121 ℃滅菌15 min即得。

表2 他克莫司納米混懸液全因子試驗設計及結果

由結果分析可知，攪拌速度和藥物-溶劑比是顯著影響他克莫司混懸液粒徑的主要因素，為了研究攪拌速度和藥物-溶劑比對粒徑的影響情況，繪制了D50和D90的等值線圖，其中在等值線圖里控制了溶劑-反溶劑比例為1:40，攪拌時間為6 h。由圖2可見快速攪拌、較小的藥物-溶劑比制備的他克莫司納米混懸液樣品的粒徑更小。

表3 D50方差分析表

1.2 納入與排除標準 納入標準：①符合手術適應證；②于本院行麥默通微創旋切術；③患者及其家屬自愿配合心理干預行為。排除標準：①合并精神障礙或有精神疾病史者；②近期發生重大生活事件者。③合并其他重大疾病者。

圖1 對D50和D90有影響的主效應和二階交互效應的分析

使用Minitab軟件對影響他克莫司納米混懸液粒徑的因素進行分析并建模擬合。對D50進行分析擬合的結果顯示其失擬P=0.37>0.05、彎曲P=0.12>0.05，對D90進行分析擬合時具有相同的規律，表明此模型合適。表3為對D50分析和擬合的結果。

圖2 D50與D90的等值線圖

根據以上試驗結果，確定他克莫司納米混懸液的最優工藝參數：藥物-溶劑比為1:4、溶劑-反溶劑比為1:40、攪拌速度為1500 r/min、攪拌時間為6 h。

2.3 優選工藝驗證

根據優化后的工藝制備3批他克莫司納米混懸滴眼液，D50為0.18～0.21 μm，沉降體積比為0.96。將樣品置溫度40 ℃±2 ℃、相對濕度75 %±5 %的條件下放置6個月，分別測定0 d和1，2，3，6月時樣品的D50、D90和沉降體積比，結果見表4。3批樣品的D50、D90和沉降體積比結果均在限度要求范圍內，6個月與0 d相比均未發生顯著變化，表明采用溶劑-反溶劑法制備他克莫司納米混懸滴眼液的工藝穩定，重復性好。

這次事件，讓我明白了很多。班主任作為班級管理的第一責任人，要敢于承認自己的錯誤，和學生站在一條線上，用自己真誠的行為打動學生。這種榜樣的力量會有更強的感染力，無形中會讓學生對你敞開心扉，把班級當成自己的家，從而有利于班級的管理和良好班風的形成。

表4 優選工藝驗證結果

3 討論

本研究采用溶劑-反溶劑法制備他克莫司納米混懸液，通過離心法去除有機溶劑制得納米微粒，加入穩定劑、pH調節劑、防腐劑、滲透壓調節劑等制成粒度D50小于0.3 μm，并具有較好穩定性的他克莫司納米混懸滴眼液。

本研究通過全因子試驗設計，研究了藥物-溶劑比、溶劑-反溶劑比、攪拌速度、攪拌時間對制備納米微粒的粒徑影響，確定最優工藝參數：藥物-溶劑比為1:4、溶劑-反溶劑比為1:40、攪拌速度為1500 r/min、攪拌時間為6 h。制備的3批他克莫司納米混懸滴眼液D50均在300 nm內，沉降體積比均＞0.90；樣品進行加速試驗考察，6個月樣品的粒徑和沉降體積比與0 d樣品比較，未見顯著變化。實驗結果表明：優選的他克莫司納米混懸滴眼液制備工藝可行，產品質量可控，穩定性良好。