桑辛素大鼠體內代謝產物鑒定

鄧志鵬，柳 佳，熊 山，韓利文

（山東第一醫科大學，山東省醫學科學院 藥物研究所，山東 濟南 250062）

桑辛素（morusin，5, 2’, 4’-三羥基黃酮），又稱桑黃素，存在于?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥根皮、樹枝及桑葚中[1-2]。現代藥理研究證明，桑辛素具有抗腫瘤[3-6]、抗菌[7]、抗炎[8]等藥理活性。桑辛素屬異戊烯基黃酮類化合物，化學結構見圖1。體內外藥理實驗證明，黃酮類化合物具有較為顯著的藥效，但因該類化合物在體內可發生廣泛的I相和II相代謝反應，導致其生物利用度較低[9-10]。因此，研宄該類化合物在體內的吸收及代謝過程對其藥物開發有重要影響。目前桑辛素的體內代謝過程研究較少，亟需進一步研究。

圖1 桑辛素的化學結構

1 材料與儀器

1.1 儀器

Thermo Scientific超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher）；EL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機（中國賽默飛世爾）；IKA Vortex天才3旋渦混勻器（廣州艾卡）；氮吹儀（青島聚創環保）。

1.2 藥品與試劑

桑辛素對照品（批號：HM05275198，經HPLC 測定其純度99.48 %，寶雞辰光）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國Sigma-Aldrich公司）；甲醇，乙腈，乙酸銨為色譜純級別；水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 實驗動物

健康雄性SD大鼠，體重為200±20 g，由濟南朋悅動物繁育公司提供，許可證號為SCXK（魯）20140007。實驗期間大鼠在恒定環境下飼養，相對濕度為55 %±15 %，飼養溫度為23±3 ℃，日溫差≤4 ℃，晝夜明暗交替時間10 h/14 h，并可自由飲食飲水。

2 方法與結果

2.1 桑辛素混懸液的配制

稱取桑辛素粉末適量，置于10 ml量瓶中，加入適量0.5 %CMC-Na溶解，定容，配制成20 mg/ml桑辛素混懸液，臨用前配制。

2.2 色譜條件

Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2.0 min，10 % B；2.0～20 min，10 %B→95 %B；20～27 min，95 %B；27～27.1 min，95 %B→10 %B；27.1～30 min，10 %B；流速0.6 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μl。

2.3 質譜條件

離子源為電噴霧離子化源（ESI），負離子模式；質量掃描范圍m/z100～1200；噴霧電壓：3500 V，離子傳輸管溫度：320 ℃，鞘氣壓力：45 arb；輔助氣壓力：10 arb。

2.4 樣品采集

將4只SD大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組 2只，實驗前適應性喂養一周。給藥組大鼠按20 mg/kg灌胃給予桑辛混懸液，置于代謝籠中，給藥后2，4，8 h分別對各組進行眼眶取血，置于含肝素鈉的EP管中， 4 ℃下、10 000 r/min離心5 min，取上層清液，放入-80 ℃冰箱備用?？瞻捉M大鼠灌胃等體積0.5 % CMC-Na溶液。將4只SD大鼠隨機分為空白組和給藥組，給藥組大鼠按20 mg/kg灌胃給予桑辛混懸液，空白組大鼠灌胃給予等體積0.5 %CMC-Na溶液，置于代謝籠中，給藥后分別收集0～6 h、6～12 h、12～24 h的尿液和0～12 h、12～24 h的糞便，放入-80 ℃冰箱保存。

2.5 樣品制備方法

分別取大鼠給藥后的不同時間點（段）的血漿、尿液、糞便樣品，按AUC混合法（AUCpooling）原則進行樣本混合。血漿：加3倍量甲醇，渦旋混合5 min后，13 000 r/min離心3 min，取上清。尿液：經15 000 r/min離心20 min后，取其上清。糞便：干燥后研磨成粉末狀，稱取100 mg，加入1 ml甲醇超聲提取20 min，15 000 r/min離心10 min，取全部上清吹干后，加入流動相渦旋混合2 min，取上清，經0.22 μm 濾膜濾過，取 5 μl 進樣分析。

2.6 對照品質譜分析

低碰撞能量質譜中，主要檢測到桑辛素的[M-H]-離子（m/z419.1500），其保留時間為20.14 min。高碰撞能量質譜圖中，主要碎片離子為m/z297.11，191.07，109.03，推測其可能的斷裂途徑見圖2。

圖2 桑辛素的主要裂解途徑

2.7 含藥樣品超高效液相色譜-高分辨質譜（UPLC-HRMS）分析

利用Q-Exactive plus orbitrap質譜儀自帶的Compound Discoverer 3.0.0.294軟件，根據樣品的一級、二級質譜圖，并與相應的空白樣品對比尋找潛在的代謝產物。結果顯示大鼠灌胃給予桑辛素后，血漿中出現了4個主要的色譜峰。通過代謝物鑒定軟件Compound Discoverer 3.0.0.294及Xcalibur數據采集功能，對上述 4個色譜峰進行定性分析，確證為原形M0和3個代謝產物M1，M2-1和M3[11-12]。尿液中出現了2個主要的色譜峰，通過代謝物鑒定軟件及Xcalibur數據采集功能，對上述 2個色譜峰進行定性分析，確證為2個代謝產物M2-1和M3；糞便中出現了7個主要的色譜峰。通過代謝物鑒定軟件及Xcalibur數據采集功能，對上述 7個色譜峰進行定性分析，確證為原形M0和6個代謝產物M1，M2-1～M2-3，M4和M5。見圖3、表1。

表1 桑辛素的大鼠血漿、尿液和糞便推測代謝產物

圖3 大鼠體內桑辛素代謝物的離子流色譜圖

M1：保留時間為 16.36 min，m/z435.1449，比M0（m/z419.1500）多16，主要碎片離子m/z313.11，比原形桑辛素的子離子碎片（m/z297.11）多16。因此推測M1為羥基化代謝產物。

M2-1～M2-3：保留時間分別為13.09，10.41和1 3.4 3 m i n，m/z5 9 5.1 8 2 1，比M 0（m/z419.1500）多176，推測可能為葡萄糖醛酸化代謝產物。二級質譜產生特異性子離子m/z419.15，推測為葡萄糖醛酸化代謝產物脫去1分子葡萄糖醛酸產生碎片離子，此外3個代謝產物的子離子m/z297.11，與原形桑辛素的子離子一致，因此推測M2-1～M2-3為桑辛素的3個葡萄糖醛酸化代謝產物，葡萄糖醛酸化發生在3個羥基化位置，生成了3個同分異構體。

M3：保留時間為11.15 min，m/z611.1770，比M0（m/z419.1500）多192（16+176），主要碎片離子m/z435.15，與M1一致。因此推測M3為桑辛素的羥基化加葡萄糖醛酸化代謝產物。

M4：保留時間為 12.81 min，m/z451.1398，比M0（m/z419.1500）多32，主要碎片離子m/z329.10，比原形桑辛素的子離子碎片（m/z297.11）多32。因此推測M4為雙羥基化代謝產物。

M5：保留時間為11.33 min，m/z517.1174，比M0（m/z419.1500）多98（2+16+80），主要碎片離子m/z435.15，與M1一致。因此推測M5為桑辛素的加氫還原加羥基化加硫酸化反應產物。

3 討論

HRMS技術顯著提高代謝物鑒定的準確度和分析通量，在天然活性成分代謝產物鑒定研究中起到不可替代的作用[13]。本課題組前期研究報道[14-15]，大鼠灌胃給予桑辛素和桑白皮提取物后，采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜評價了原形桑辛素在正常大鼠和糖尿病模型大鼠中的血漿藥動學。目前對桑辛素的體內代謝研究很少。由于桑辛素分子結構中含3個酚羥基基團, 在負離子ESI模式下, 桑辛素易形成脫氫離子[M-H]-，其m/z419.15。本研究采用負離子模式鑒定桑辛素的代謝產物，采用UPLC-Q-Exactive plus orbitrap-MS技術，對桑辛素灌胃20 mg/kg后在大鼠血、尿、糞中的代謝產物進行了分析及鑒定。分析各代謝物的二級質譜圖，通過與原形藥物二級質譜圖及質譜裂解規律進行比較，結合Compound Discoverer 3.0.0.294軟件進行分子式的擬合，共鑒定了除原形藥物之外的7個代謝產物，其中包括代謝物M2的3個同分異構體（M2-1～M2-3）。從代謝物的結構來看，原形藥物在體內主要發生了羥基化和葡萄糖醛酸化等反應，其中代謝產物M2出現的同分異構體，可能是原形藥物本身結構的原因，也可能是由于發生代謝反應時反應的位點不同。具體為血漿和糞便中除原形化合物外，還有羥基化產物和葡萄糖醛酸結合物。尿中未檢出原形化合物，主要代謝物為原形的葡萄糖醛酸結合物（M2-1）和原形的羥基化+葡萄醛酸結合物（M3）。