基于表面等離子體共振技術篩選與轉錄因子AP-2γ具有高親和力的小分子化合物

賴丹寧，張逸菲，王培鑫，林少玲，胡嘉淼＊

（1. 閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2. 福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002）

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種無標記的生物分析技術，常用于檢測金屬/介電界面上的生物分子相互作用[1-2]。它可用于鑒定并量化分子相互作用，如蛋白質-核酸、蛋白質-蛋白質、蛋白質-小分子化合物等相互作用的結合親和力[3-6]。AP-2γ轉錄因子屬激活蛋白2轉錄因子家族。該家族由4個不同的成員組成，分別為AP-2α，AP-2β，AP-2γ及后來發現的AP-2δ[7]。目前研究表明，該家族所有成員都有一個獨特的介導蛋白質二聚化的螺旋-環-螺旋（helix-span-helix）結構；而N端富含脯氨酸和谷氨酰胺的區域介導轉錄激活[8]。許多研究表明，惡性腫瘤與AP-2γ蛋白的過量表達及活性異常有關[9-12]。因此，尋找可有效抑制AP-2γ活性的小分子化合物被認為是潛在的腫瘤藥物開發策略。

本文采用SPR技術篩選美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的藥物分子庫中，同AP-2γ蛋白存在高親和力的小分子化合物，并測定樣品間相互作用的動力學常數，以期為新型抗腫瘤藥物的開發提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PlexArray?HT生物分子相互作用分析儀（美國Plexera公司）。

1.2 材料

AP-2γ蛋白（DetaiBio公司，純度>90 %）；DA1018藥物芯片（美國Plexera公司），芯片上打印有FDA批準的1018種小分子化合物及陰性對照二甲亞砜（DMSO）、陽性對照雷帕霉素（rapamycin）；DMSO（北京索萊寶）；丙三醇（國藥集團）；甘氨酸（北京索萊寶）；1×PBS（pH 7.4，北京索萊寶）。

2 方法

2.1 流通相及固定相的制備

選擇FDA 分子庫的 1018 種小分子作為固定相，由廠家預先通過3D光交聯方式打印于SPR芯片表面；流通相選擇AP-2γ蛋白溶液，使用前將AP-2γ蛋白原液用1×PBS（pH 7.4）及10 %丙三醇緩沖液稀釋成3 個濃度梯度（5 0 0，2 5 0，1 2 5 nmol/L）。

2.2 SPR實時動力學分析

用生物分子相互作用分析儀加載打印有目標分子的芯片，隨后加載不同濃度梯度（500，250，125 nmol/L）的AP-2γ蛋白樣品各 650 μl，流速為2 μl/s，結合時間為300 s，解離時間為300 s。用鹽酸甘氨酸（pH 2.0）溶液作為重生液。所得的3次數據通過Plexera SPRi 系統計算并獲得平均值。

3 結果

3.1 系統基線建立及芯片質量驗證

首先以100 nmol/L 的FK506結合蛋白12（FK506-binding protein of 12 kD）作為流通相檢驗芯片質量，結果見圖1。由圖1可知，FK506結合蛋白12與陰性對照DMSO基本無相互作用，信號基本同系統背景的基線信號相仿；而FK506結合蛋白12與已知的配體雷帕霉素（陽性對照）迅速結合產生信號，響應值迅速升高，并在約300 s后達到飽和，響應值趨于穩定。提示該芯片質量檢測合格、SPR系統工作正常。

圖1 陰陽性樣點信號對照

3.2 FDA批準的1018種藥物與AP-2γ蛋白的相互作用

通過高通量SPR技術成功地從FDA批準的1018種藥物中篩選出了80種能與目標AP-2γ蛋白特異性結合的藥物分子（見表2）。流通相AP-2γ蛋白溶液流過芯片過程中，與芯片上80個結合樣點發生結合所生成的響應值見圖2。

根據圖2，截取600～700 s時間段內的響應值，分別求平均值，可得AP-2γ蛋白（500 nmol/L）與芯片上結合樣點的解離穩定階段的最大響應值（RUmax）。如圖3所示，AP-2γ蛋白與S4190（辛可芬，cinchophen）相互作用的解離穩定階段的RUmax最大，其次是S3105（那氟沙星，nadifloxacin）、S1761（舒洛芬，suprofen）和S4166 （氯磺丙脲，chlorpropamide）。

圖2 500 nmol/L AP-2γ與芯片上結合樣點的結合情況

圖3 AP-2γ 蛋白（500 nmol/L）與芯片上的結合樣點的平均最大信號

3.3 樣品與AP-2γ蛋白結合情況的驗證

將不同濃度的AP-2γ蛋白（500，250，125 nmol/L）流過芯片，分別測定其響應值變化曲線，見圖4。由圖4可見，相互作用所呈現的響應值曲線均符合結合-解離循環的特征，即SPR測定結果表明測定信號響應值均呈穩定、上升、穩定、小幅下降、穩定趨勢。這是由于前100 s時，儀器管道中只有緩沖液，故信號保持穩定、平坦；100 s后儀器開始進樣蛋白流通相，溶液中蛋白濃度突然上升，樣點上開始逐漸結合蛋白，此時實時檢測信號開始上升；流通相流通一定時間后，AP-2γ蛋白與芯片上結合樣點結合至飽和狀態，故實時檢測信號到達峰值，曲線大致維持平穩；約300 s開始，緩沖液流通進芯片，將未結合的蛋白洗脫下來，實時檢測信號變弱，檢測信號開始不斷下降，此為解離階段；解離完成后，信號曲線趨于平穩[13]。此外，隨著流通相濃度的增加，特異性結合信號逐漸增強。

圖4 AP-2γ與樣品S4190（a），S3105（b）， S1761（c）和S4166（d）的濃度梯度結合曲線

3.4 動力學數據分析

FDA批準的藥物分子庫中，能與AP-2γ蛋白特異性結合的小分子共有80種。通過對這80種小分子與AP-2γ蛋白的親和力常數（KD）進行計算，可發現KD集中在10-9～10-7mol/L左右，證實測得特異性結合能力強，見表1。

表1 目標藥物與AP-2γ蛋白結合的動力學、親和力

表1（續）

進一步以10為底，對FDA批準的藥物分子庫樣品與AP-2γ蛋白的結合常數平均結合速率常數（Avg Kon），平均解離速率常數（Avg Koff）取對數進行分析，可得結合能力動力學分布圖（見圖5），可見這80種小分子與AP-2γ蛋白的特異性結合絕大部分都在類型一、三區域內，結合都是穩定的。

圖5 80種小分子化合物與AP-2γ蛋白的結合能力動力學分布圖

4 討論

SPR技術靈敏度高，特異性強，能實現高通量檢測，并可實時監測化學生物反應過程，為抗腫瘤藥物開發提供了有力的研究工具。本研究中，我們采用了SPR技術對抗腫瘤的潛在藥物進行篩選。在FDA批準的1018種藥物中，我們確定了80種與AP-2γ蛋白具有較高的親和力、有可能應用于腫瘤治療的潛在藥物。其中，氯磺丙脲（chlorpropamide）對AP-2γ蛋白的親和力最強，其次是甲溴辛托品（anisotropine methylbromide）、維生素D3 （Vitamin D3）、扎托布洛芬（zaltoprofen）、羥萘酸芐酚寧（bephenium hydroxynaphthoate）、吡硫翁鋅（pyrithione zinc，PYZ）、阿西美辛（acemetacin、雷米普利（ramipril）、阿昔洛韋（acyclovir）、那氟沙星（nadifloxacin）等。

其中值得關注的如維生素D3在癌癥的發病機制和過程中的重要性已通過體外研究、動物研究及流行病學研究得到證實。Amir等[14]報道乳腺癌骨轉移患者每天服用10 000 IU維生素D3和1000 mg鈣補劑能顯著減少疼痛部位的數量。Fife等[15]發現維生素D3能顯著抑制雌激素受體陰性、孕激素受體陰性的人乳腺癌細胞系MDA-MB-435、人前列腺癌細胞系LNCaP和人骨肉瘤細胞系U2OS的體外增殖。Swami等[16]研究發現，與對照組（飼料含1000 IU/kg維生素D3）相比，在4周維生素D3補充飲食（飼料含5000 IU/kg維生素D3）后，攜帶MCF-7乳腺癌異種移植瘤的免疫功能受損小鼠的腫瘤顯著縮小（>50 %）。Marshall等[17]研究發現每天補充4000 IU維生素D3可降低低風險前列腺癌患者重復活檢陽性率。此外，在一些研究中，維生素D代謝物（25-羥基維生素D）水平較低被證實與乳腺癌預后不良有關[14]。

吡硫翁鋅（pyrithione zinc，PYZ）是一種鋅的配位復合物，被FDA批準為非處方局部抗菌藥物，用于治療銀屑病和B波段紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）誘導的表皮增生[18]。近年多項研究表明，PYZ在癌癥干預方面具有應用潛力。Srivastava等[18]研究發現PYZ可有效降低口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細胞的集落形成、遷移和侵襲的能力；其機制主要涉及PYZ引起OSCC細胞中PI3K/AKT/mTOR和WNT/b-catenin等信號通路的改變，降低了14-3-3z、14-3-3s、cyclin D1、c-Myc、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2）等蛋白的表達。此外，PYZ治療還被證實可顯著減少免疫受損NOD/SCID/Crl小鼠的移植成瘤體積，而不會對正常組織造成明顯的毒性。項航[19]研究發現PYZ可在胃癌細胞中通過改變溶酶體膜通透性抑制自我保護性自噬，還可抑制異種皮下移植瘤的生長。Tailler等[20]在FDA批準的1040種藥物中發現PYZ和哇巴因（ouabain，OUA）是潛在的抗白血病藥物，PYZ和OUA均能有效誘導急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）細胞凋亡，誘導凋亡染色質凝聚和抑制核因子-κB存活信號（nuclear factor-κB survival signaling），導致抗凋亡蛋白表達減少。

氯磺丙脲、甲溴辛托品、扎托布洛芬等藥物目前雖然還沒有應用于癌癥治療的相關報導，但相比其他藥物，它們具有與AP-2γ蛋白親和力高、結合穩定等優勢，仍具有很大的發展成為抗癌藥物的潛力。本文從現有的已被FDA批準的1018種藥物中尋找能AP-2γ蛋白特異性結合，并具有較高親和力的藥物，可有效減少研究周期，便于藥物更快地服務于臨床。

5 結論

綜上，本文利用高通量SPR技術，從FDA批準的藥物庫篩選出能與AP-2γ蛋白產生特異性結合的80種小分子藥物，并得到了相應的動力學常數。在后續的研究中，需對AP-2γ蛋白與目標樣品的結合情況進行挑選驗證，可結合解離穩定階段的平均最大信號值RUmax及各結合樣點的親和力來挑選結合信號強、親和力大的藥物進行相關驗證試驗。