HPV DNA 和HPV E6/E7 mRNA 檢測在宮頸病變診治中應用價值的比較

劉曉旭，梁建梅，蘇學艷，王素娟，趙會娟，秦麗欣，盧雪景，王亞凡

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅廣大女性的健康，且絕大多數發生在發展中國家。據報道，其發病率居我國女性惡性腫瘤的第2 位[1]。我國每年宮頸癌新發病例約10 萬例[2]，防治形勢相當嚴峻。因此，宮頸癌篩查是我國重大公共衛生項目。由于99.7%的宮頸癌與高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染有關[3]，宮頸液基薄層細胞學檢查（thin-prep cytology test，TCT）聯合HPV DNA檢測已成為臨床上宮頸癌篩查的主要方法。而Shen等[4]研究發現，HPV E6/E7 mRNA 的表達能反映HPV的基因活性，從而推斷出HPV 的感染水平和致癌能力，目前已在臨床上廣泛應用。因此，本研究旨在比較HPV E6/E7 mRNA 和HPV DNA 這2 種檢測方法對ASCUS 患者宮頸病變的診斷效果和價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018 年1 月—2019 年9 月在石家莊市婦幼保健院行TCT 檢查的患者共33 496 例。篩選符合納入標準的診斷意義不明的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）的患者3 190 例，其中30～39 歲的患者最多，占31.32%；60～65 歲的患者最少，占5.32%，見表1。采用隨機分組法分為2 組，每組各1 595 例。對照組年齡（36.0±3.8）歲，觀察組年齡（35.2±3.6）歲，差異無統計學意義（t=3.091，P=0.690）。納入標準：①年齡20～65 歲；②自愿接受各項宮頸癌篩查方法；③性生活史≥3年；④TCT 診斷為ASCUS，診斷依據為2004 年國際癌癥協會推薦的TBS（The Bethesda System）報告方式及其診斷標準[5]。排除標準：①既往TCT 檢查異常和已確診宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）或宮頸癌的患者；②妊娠期、急性生殖道炎癥；③有宮頸手術史或盆腔放療史；④檢查3 d 內陰道用藥史。

表1 3 190 例ASCUS 患者的年齡分布情況

1.2 研究方法

1.2.1 檢測方案對照組行HPV DNA 檢測，觀察組行HPV E6/E7 mRNA 檢測。2 組中的陽性患者（對照組中HPV DNA陽性；觀察組中HPV E6/E7 mRNA 陽性）均行陰道鏡檢查＋宮頸活檢+病理組織學診斷。最后比較2 組患者宮頸病變（包括CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌）的陽性率。為了進一步比較兩種方法的診斷效能，對照組陽性患者中隨機抽取184 例進行HPV E6/E7 mRNA 檢測，觀察組陽性患者中隨機抽取184 例進行HPV DNA 檢測，即最終有368 例患者同時進行了2 種方法的檢測和病理組織學診斷。

1.2.2 TCT 檢測患者取膀胱截石位，窺陰器充分暴露宮頸，無菌棉簽輕輕擦拭宮頸表面分泌物，宮頸刷沿同一方向刷取宮頸表面脫落細胞。將毛刷置于取樣瓶中等待檢測。

1.2.3 HPV DNA 檢測采用廣東凱普公司生產的醫用核酸分子快速雜交儀。聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀為美國Applied Biosystems real time PCR7500。檢測21 種HPV 亞型，低危型包括HPV6、11、42、43、44 和81 共6 種亞型，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66 和68共15 種亞型。

1.2.4 HPV E6/E7 mRNA 檢測使用美國Hologic 公司產的Aptima HPV E6/E7 mRNA 檢測試劑盒，采用Aptima（轉錄介導的等溫擴增技術，transcription mediated amplification，即TMA 技術）檢測14 種高危型HPV E6/E7 mRNA。結果包括HPV16（E6/E7 mRNA）、HPV18/45（E6/E7 mRNA）和其他高危型HPV（E6/E7 mRNA，包括31、33、35、39、51、52、56、58、59、66和68，不具體分型）。

1.2.5 陰道鏡檢查與活檢使用電子陰道鏡系統（美國Apple 公司）觀察宮頸表面色澤、邊界、形態和血管。使用4%醋酸溶液涂抹整個宮頸，仔細觀察后用碘液涂抹。對白色病變、碘不著色等可疑病變部位多點活檢，Ⅲ型轉化區（鱗柱交界完全不可見）行宮頸管搔刮術。所有病理標本由2 名正高級病理醫師進行閱片及診斷。根據《婦產科學》[5]中的標準確定病理學結果，包括宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌。其中，≥CINⅡ級稱為高級別宮頸上皮內病變。

1.3 統計學方法采用SAS 9.1 軟件進行統計學分析。定性資料采用例數（構成比、百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組患者的檢測結果及病理檢查結果比較對照組中417 例HPV DNA 檢測陽性，陽性率為26.1%；觀察組中402 例HPV E6/E7 mRNA 檢測陽性，陽性率為25.2%。2 組檢測陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=0.370，P=0.543）。對照組高級別宮頸上皮內病變患者的檢測陽性率為4.8%（77/1 595），觀察組高級別宮頸上皮內病變患者的檢測陽性率為4.1%（66/1 595），2 組比較差異無統計學意義（χ2=0.595，P=0.440）。見表2。

表2 2 組患者的檢測結果比較（例）

2.2 對照組中HPV18、HPV16 及其他亞型陽性患者高級別宮頸上皮內病變檢出率的比較對照組中HPV 陽性患者（417 例）中，HPV18 陽性者44 例，HPV16 陽性者205 例，其他HPV 亞型陽性者168例。HPV18、HPV16 及其他HPV 亞型陽性患者的高級別宮頸上皮內病變檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=16.313，P=0.000）。其中，HPV16 陽性患者的高級別宮頸上皮內病變檢出率高于HPV18 陽性及其他HPV 亞型陽性患者（χ2分別為9.557 和9.356，P均為0.002），而HPV18 陽性患者與其他HPV 亞型陽性患者比較，差異無統計學意義（χ2=1.759，P=0.185）。見表3。

表3 HPV18、HPV16 及其他HPV 亞型陽性患者高級別宮頸上皮內病變檢出情況 [例（%）]

2.3 HPV16 陽性患者與其他HPV 亞型陽性患者中高級別宮頸上皮內病變檢出率的比較觀察組中HPV16 陽性者有282 例，對照組中HPV16 陽性者有205 例，2 組共有487 例。其中，宮頸炎癥和CINⅠ級的患者有366 例（75.2%），CIN≥Ⅱ級的患者有121例（24.8%）。感染其他HPV 亞型患者共332 例，其中，宮頸炎癥和CINⅠ級的患者有310 例（93.4%），CIN≥Ⅱ級的患者有22 例（6.6%）。HPV16 陽性患者與其他HPV 亞型陽性患者的高級別宮頸上皮內病變檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=45.472，P＜0.000 1）。

2.4 2 種檢測方法診斷效能的比較368 例ASCUS的患者同時進行HPV DNA 檢測、HPV E6/E7 mRNA檢測和病理組織學診斷，見表4。HPV E6/E7 mRNA檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、約登指數均高于HPV DNA 檢測，見表5。如果將HPV檢測結果陽性作為ASCUS 患者轉診陰道鏡的依據，HPV E6/E7 mRNA 的陰道鏡轉診率為42.4%（156/368），HPV DNA 為50.5%（186/368），差異有統計學意義（χ2=4.916，P=0.027）。

表4 2 種檢測方法的病理結果比較（例）

表5 2 種檢測方法對高級別宮頸上皮內病變的診斷效能比較（%）

3 討論

3.1 宮頸癌篩查方法的演變宮頸癌是唯一一種病因明確并且可以預防的惡性腫瘤[6]。盡早發現宮頸癌及癌前病變的患者，并進行及時、規范的管理和治療，可以降低宮頸癌的發病率和死亡率[7-8]，甚至消滅宮頸癌，這也是我國兩癌篩查的終極目標。TCT 檢查一直是宮頸癌篩查的主要方法。但由于閱片者主觀因素對結果有較大影響，重復性差，從而導致細胞學篩查結果的準確性較低[9]，檢出率的波動范圍也較大。本研究33 496 例女性中，ASCUS 患者為3 190例，占9.5%，明顯高于潘學景等[10]的報道（1.8%）。眾所周知，宮頸癌的發生發展與高危型HPV 感染密切相關[11]。目前，HPV DNA 檢測已逐漸應用到宮頸癌篩查中[12-13]，并成為重要輔助手段，也成為ASCUS 患者分流管理的重要方法。但絕大多數HPV 的感染為一過性，可以在2 年之內清除，并不致病，從而導致宮頸癌篩查的假陽性率增高[14]。如何發現高危型HPV持續感染的患者，提高宮頸癌篩查的準確性，降低陰道鏡的轉診率，減少對患者身體和心理的創傷，成為當今醫學領域研究的熱點。

研究表明，HPV 病毒中導致宮頸癌的主要致病基因是E6/E7 基因[15]。E6 基因通過抑制宿主P53 基因表達阻斷細胞凋亡過程，影響相關細胞的抗癌作用；E7 基因可抑制pRB 基因表達影響細胞周期，促進炎癥細胞大量增殖惡變，進而發展為癌癥[16]。HPV E6/E7 mRNA 的水平能夠預測HPV 病毒活性及癌變風險[17]，進而將一過性感染和宮頸病變區分開來[18]。Ren 等[19]提出HPV E6/E7 mRNA 檢測可能是臨床工作中ASCUS 分流的一種更有價值的方法。

3.2 HPV E6/E7 mRNA 和HPV DNA 檢測對于高級別宮頸上皮內病變診斷價值的比較本研究結果顯示觀察組和對照組高級別宮頸上皮內病變檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。Zhang 等[20]的研究也得出了相似的結論。魏彩平[21]也認為這2 種檢測方法對宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌的檢出率差異均無統計學意義。但在進一步研究中，368 例患者同時進行2 種方法檢測。以組織病理學結果為金標準，HPV E6/E7 mRNA 檢測對于高級別宮頸上皮內病變的診斷效能優于HPV DNA 檢測，其敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均較高。王蘭英等[22]的研究，也得出了同樣的結論。Zhu 等[23]也認為HPV E6/E7 mRNA 檢測對于高級別宮頸上皮內病變具有較強的特異性。此外，國外的一項研究通過對ASCUS 患者進行5 年的隨訪發現，HPV E6/E7 mRNA 陽性者發生高級別宮頸上皮內病變的風險高于HPV DNA 陽性者[24]，這說明HPV E6/E7 mRNA 對于宮頸病變的進展具有較好的預測價值[10]。此外，本研究還發現如果將HPV 檢測結果陽性作為ASCUS患者轉診陰道鏡的依據，HPV E6/E7 mRNA 檢測的陰道鏡轉診率為42.4%（156/368），低于HPV DNA檢測的陰道鏡轉診率[50.5%（186/368）]，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.3 HPV18、HPV16 及其他亞型陽性患者高級別宮頸上皮內病變檢出率的比較及意義70%以上的宮頸癌是由HPV16 和18 亞型感染導致的[25]。本研究發現，HPV16 陽性的患者中，高級別宮頸上皮內病變的檢出率明顯高于其他HPV 亞型陽性的患者。這說明HPV16 亞型的毒力強，致癌率高，是監測管理的重點。但在臨床中，感染HPV18 亞型的患者非常少見。對照組417 例HPV 陽性的患者中，僅有44 例HPV18 亞型陽性（4.3%）。Zhang 等[20]的研究也證實，在所有宮頸上皮內病變的患者中，HPV18 亞型的陽性率不足7%。而且，在44 例患者中，僅有2 例病理診斷為高級別宮頸上皮內病變，檢出率4.5%，甚至低于其他HPV 亞型陽性患者的高級別宮頸上皮內病變檢出率。因此，美國陰道鏡和宮頸病理學協會（American Society of Colposcopy&Cervical Pathology，ASCCP）推薦無論TCT 結果如何，HPV18 亞型感染的患者均應行陰道鏡檢查甚至宮頸活檢的意見在石家莊市婦女中并不適用，因為這樣會顯著增加HPV18 亞型陽性患者的陰道鏡轉診率，并且使患者在漫長的復查等待過程中承受嚴重的生理痛苦和精神壓力。筆者認為，HPV 感染和宮頸癌的發生可能存在地域差異。因此，對于石家莊市HPV18 亞型陽性的患者應與HPV16 亞型陽性的患者區別對待，避免過度治療。

綜上所述，相較于HPV DNA 檢測，HPV E6/E7 mRNA 檢測在高級別宮頸上皮內病變的檢出率方面無明顯優勢，但它具有較高的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，診斷效能高、陰道鏡轉診率低，可以作為ASCUS 患者分流管理的新方法。同時本研究發現，HPV16 亞型致癌率高，應該給予高度重視，嚴密隨訪，積極診治。而HPV18 亞型的致病力與其他HPV 亞型無差異，臨床上要避免不必要的陰道鏡轉診，減輕患者的心理負擔。當然，本研究也存在一些不足之處。首先，診斷效能實驗的樣本量偏小，今后要進一步擴大樣本量，增加研究的可靠性；其次，由于儀器設備的局限性，本研究未對HPV E6/E7 mRNA 做定量分析，無法得知病毒載量與病變程度的關系；最后，在臨床工作中，要加強對HPV 陽性患者的隨訪，進一步比較HPV E6/E7 mRNA 和HPV DNA 對高級別宮頸上皮內病變的預測價值。