缺血性腦卒中不同證候及表型與WD重復域5B基因多態性的相關性

古聯 陳卓 梁琳梅 朱路路 周文君 龍建雄 蘇莉

(廣西中醫藥大學 1第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2研究生院；3廣西醫科大學公共衛生學院)

缺血性腦卒中(IS)在中醫學中可歸屬于“中風”范疇。遺傳因素與環境因素共同作用促使發生IS，其中遺傳因素在 IS 的病變過程中起著不可或缺的作用〔1〕。IS的中醫證候是對該病某個階段或某個類型的病理概括，根據其不同臨床特點可辨證分為數個證候。研究表明組學相關研究可揭示中醫證候的內在分子基礎，其中基因遺傳多態性可能是中醫證候的微觀生物學標志，其影響個體疾病的差異表現，兩者關系密切〔2〕。WD重復域(WDR)5B基因編碼含有數個WD40重復序列的蛋白質，研究發現，WD40重復序列蛋白家族在信號傳導、mRNA加工、基因表達調控、細胞凋亡等方面發揮重要作用〔3〕。目前發現多種人類疾病與該重復蛋白家族基因突變相關〔4〕。在神經研究方面，也已報道多種WD40重復序列家族蛋白與氧化應激、細胞損傷、神經再生相關〔5，6〕。現暫未見IS及其中醫證候與WDR5B基因多態性的關聯研究報告。本研究就IS各中醫證候及臨床表型與WDR5B基因rs9843165多態性的相關性進行病例-對照研究，以探討IS患者中醫證候的發生發展是否具有一定基因遺傳特征及臨床表型相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究共納入IS患者774例，對照組793例。以廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科(一區、二區)為病例組納入點，收集兩個區2015～2019年收治的IS住院病例。選擇同時期該院及社區體檢中心的參加健康體檢者作為對照組。納入標準：病例組：①需符合中醫診斷及西醫診斷標準。中醫疾病診斷依照國家中醫藥管理局制訂的《中風病診斷與療效評定標準(試行)》中的IS的診斷標準〔7〕；西醫診斷參照第四次全國腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點》其中的IS的診斷標準〔8〕；本研究內IS證候診斷則采用國家中管局制定的《中風病辨證診斷標準(試行)》〔9〕。②起病均為72 h之內的急性期IS患者。③所有患者行頭顱CT和(或)頭顱磁共振成像(MRI)+磁共振彌散成像(DWI)檢查以明確診斷。對照組：應為一般正常人，既往不存在神經系統疾病病史或家族史者；年齡和性別分布與本研究中的病例組有可比性。患者自我報告為中國漢族人群，研究對象之間均無血緣關系。排除標準:病例組：①短暫性腦缺血發作、腦血管畸形、血液系統疾病及藥物等其他因素引起的IS；②嚴重心功能不全、嚴重肝腎功能不全、合并有感染性疾病或嚴重免疫系統疾病的患者；③不依從者。對照組：①伴有嚴重心臟、肝臟或腎臟疾病者；②有自身免疫系統疾病者，或正在使用免疫抑制劑或激素者。對照組女356 例，男437例，平均年齡(63.81±10.36)歲。病例組女315例，男459例，平均年齡(64.12±10.34)歲。兩組性別構成差異無統計學意義(χ2=2.815，P=0.093)，兩組平均年齡分布差異無統計學意義(t=-0.582，P=0.561)，具有可比性。病例組行中醫辨證，風證315例、火熱證86 例、痰證346例、血瘀證173例、氣虛證88例、陰虛陽亢證17例(各證之間有重疊)。本研究標陰虛陽亢證樣本量過少，故后續統計分析不計入該證候病例。

1.2研究方法

1.2.1中醫辨證標準 采用國家中醫藥管理局制定的《中風病辨證診斷標準(試行)》對IS患者進行辨證及證候賦分。該標準綜合了中醫診斷要素，如起病緩急、臨床特點、二便情況、舌脈象等，將IS精簡概括為6個具有臨床代表性的證候，包括風證、火熱證、痰證、瘀血證、氣虛證、陰虛陽亢證，同時賦分，分數≥7分則該證候診斷成立，分值越高則該證候特征越明顯。所有病例組均經2名主治醫師以上職稱的中醫師根據前述標準四診合參進行辨證，若2名中醫醫師對同一患者的證候辨證結果不一致，即提交至副主任醫師以上職稱的中醫醫師確定證候評分。所有研究的對象知情同意并簽訂同意書。研究方案已通過廣西醫科大學醫學倫理委員會審核同意。

1.2.2基因分型檢測 采集受試者2 ml的清晨空腹外周靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，采用血液基因組 DNA 提取試劑盒 (北京天根科技有限公司)，依說明書提取研究對象血液樣本的基因組DNA。使用1.25%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的擴增片段后以進行DNA質檢，同時進行OD值檢測，質檢合格的DNA即轉移至-80℃的低溫冰箱凍存備用。引物設計及合成交由生物公司完成。第一引物序列：5′-ACGTTGGATGCCGTAACCTCACACATTAAC-3′；第二引物序列：5′-ACGTTGGATGGCGTGTTTATCATGTCTCCG-3′。利用 Sequenom 基因分型平臺對WDR5B基因rs9843165多態性位點進行基因分型檢測。

1.2.3收集指標 ①一般指標：年齡、性別、民族。②臨床指標：活化部分凝血酶原時間 (APTT)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、國際標準化比率(INR)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶原時間活動度(PTA)、血小板(PLT)、載脂蛋白A1(apo-A)、apo-B、總膽固醇(TC)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、同型半胱氨酸(Hcy)等。

1.3統計學方法 應用PLINK軟件進行χ2檢驗、非條件 Logistic回歸模型分析、Linear回歸分析。上述關聯分析均采用加性模型、隱性模型、顯性遺傳模型進行。采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1WDR5B基因rs9843165多態性位點的哈溫平衡檢驗及基因型頻率分布比較 對照組WDR5B基因rs9843165位點基因型頻率分布Hardyweinberg平衡(P=0.114)，本研究所涉及的樣本具有群體代表性。IS各病例證候組(風證組、火熱證組、痰證組、血瘀證組、氣虛證組)與對照組之間的基因型頻率分布差異均無統計學意義(P>0.050)。見表1。

表1 WDR5B基因rs9843165多態性位點的基因型頻率分布比較(n)

2.2WDR5B基因rs9843165多態性與IS易感性的關聯 在校正性別年齡前，WDR5B基因rs9843165多態性與 IS 易感性的關聯均無統計學意義〔加性模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，P=0.459；顯性模型：OR(95%CI)=1.03(0.84～1.25)，P=0.801；隱性模型：OR(95%CI)=1.24(0.88～1.75)，P=0.226；等位基因模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.23)，P=0.468〕；在校正性別年齡后，該基因多態性與IS易感性的關聯亦無統計學意義〔加性模型：ORadj(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，Padj=0.431；顯性模型：ORadj(95%CI)=1.03(0.85～1.26)，Padj=0.742；隱性模型：ORadj(95%CI)=1.23(0.87～1.74)，Padj=0.236〕。

2.3WDR5B基因rs9843165多態性與IS中醫證候發生風險的關聯 在隱性模型中(CC vs CG+GG)，WDR5B基因rs9843165多態性與IS火熱證發生風險的關聯性均有統計學意義〔隱性模型：OR(95%CI)= 1.93(1.02～3.67)，P=0.044〕，而與其他四個證候未見明顯關聯性，見表2；在校正年齡、性別后，該位點與火熱證的發生風險有統計學關聯〔隱性模型：ORadj(95%CI)=1.93(1.01～3.67)，Padj=0.046〕，見表3。

表2 WDR5B基因rs9843165多態性與IS中醫證候發生風險的關聯

表3 WDR5B基因rs9843165多態性與IS中醫證候發生風險在校正后的關聯

2.4WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的凝血標志物的關聯性 在加性模型中(CC vs GG)，WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的D-D水平的關聯性有統計學意義〔加性模型：β(95%CI)=0.28(0.02～0.54)，P=0.034〕；在隱性模型(CC vs CG+GG)分析中，該位點多態性與IS患者的D-D水平顯著相關〔隱性模型：β(95%CI)=0.83(0.26～1.39)，P=0.004〕，而WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者在其他表型間的關聯無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者凝血標志物的相關分析

2.5WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的血脂水平的關聯性 對WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的血脂水平進行關聯性分析發現，WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的VLDL水平的關聯性有統計學意義〔加性模型：β(95%CI)=-0.05(-0.10～0.00)，P=0.042〕，該位點多態性與IS患者的TG水平有統計學關聯〔加性模型：β(95%CI)=-0.21(-0.42～0.00)，P=0.049〕，見表5。

表5 WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者血脂水平的相關分析

2.6WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者Hcy水平的相關分析 WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者血漿Hcy水平顯著相關〔加性模型：β(95%CI)=-0.78(-1.38～-0.17)，P=0.012；隱性模型：β(95%CI)=-1.83(-3.13～-0.53)，P=0.006〕；校正性別、年齡后分析，兩者仍具有顯著關聯〔加性模型：β(95%CI)=-0.79(-1.38～-0.21)，P=0.008；隱性模型：β(95%CI)=-2.07(-3.32～-0.81)，P=0.001〕。

3 討 論

中醫診斷思維過程的核心內容是“辨證”，所言之“證”即“證候”，是以臨床四診證據為基礎對疾病某一階段病機、病性、病位的高度概括。以此為基礎，疾病不同階段的病機病變特點則表現出不同的證候，可稱為“同病異證”，如IS在臨床可分為風證、火熱證、痰瘀證等數個證候。此外，在現代醫學中，IS根據病因特點可分為大動脈粥樣硬化型、小動脈閉塞型、心源性栓塞型等病變類型，體現出疾病的異質性。可以發現中醫證候理論中的同病異證與現代醫學的疾病異質性存在相契合點。現代醫學認為IS是基因和環境共同作用而發生的，不同基因通過對蛋白調控及表達，可反映出不同臨床類型，相關研究已表明臨床亞型的表現有分子遺傳學基礎〔10〕。相似地，有學者認為基因多態性可作為中醫證候的分子遺傳學基礎，兩者有著緊密的關聯〔2〕。吳天敏等〔11〕關于2型糖尿病的研究同樣發現基因遺傳多態性與中醫證候的密切聯系，該研究發現TCF7L2基因rs7903146多態性T等位基因可能與2型糖尿病痰熱互結證的發生相關，而與該研究其他中醫證候無明顯關聯。一項糖尿病的研究報告〔12〕，研究者對白細胞介素(IL)-6基因rs1800796多態性與高血壓中醫證型進行關聯性研究并發現基因與證候間存在陽性關聯，進一步研究發現該位點GC型可能為高血壓痰瘀互結型的風險基因型，而在其他證型間未發現風險關聯性。本研究結果提示該多態性位點可能作為IS火熱證的獨立風險位點。上述研究均不同程度提示中醫證候具有分子遺傳學基礎，對中醫的證候本質研究起一定促進作用。

WD重復域(WDR)5B基因編碼WD40重復序列蛋白，該蛋白家族功能復雜、結構保守，在信號傳導、細胞凋亡、轉錄調控發揮重要作用〔13〕。目前已有研究發現〔6〕，該蛋白家族成員通過對星形膠質細胞的氧化應激及細胞損傷在腦缺血性疾病的發生發展過程中起到相應作用。近期一項關于冠心病的研究〔14〕提示，WD40重復蛋白家族成員WDR35基因通過磷酸化途徑調控內皮細胞功能最終參與動脈粥樣硬化發展過程的調控。上述研究均提示WD40重復序列蛋白可能通過不同途徑參與心腦血管病發生發展過程。雖本研究發現，WDR5B基因rs9843165多態性與IS發生風險尚無顯著關聯，但本研究發現該基因多態性與IS火熱證發生風險的關聯性有統計學意義，提示該位點多態性可能是IS火熱證病變的影響因素。IS火熱證多出現于急性期，本研究病例組均為急性期IS患者，金代醫家劉河間強調火熱致病，指出火熱在IS的病變過程中的突出作用。IS火熱病邪致病與肝、心、胃等臟腑的關系緊密，IS病變之火熱起于心肝，而實于胃腸。心屬火，心陽亢盛則表現為火熱；肝主升發，氣機不暢則可郁而化生火熱；陽明之胃多氣多血，食入肥甘厚膩易致陽明火熱內生。火熱為病臨床表現多急，火熱之邪閉塞清竅、擾亂神明，患者出現IS基本癥狀之外常伴舌紅或絳、苔黃或燥、神煩或易怒、氣粗或口干、脈弦數或滑數。《素問·至真要大論》言“諸熱瞀瘛，皆屬于火”及出自《素問·生氣通天論》關于怒火引發IS的說法“大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，均說明火熱導致IS的重要特點。

本研究發現WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的D-D水平的具有顯著關聯。D-D作為血栓形成及纖溶反應的標志物參與動脈粥樣硬化的進展過程中，與IS關系密切〔15〕，WDR5B基因多態性則可能通過影響D-D代謝進而參與IS病變過程中。同時本研究也發現WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的VLDL水平的關聯性有統計學意義，這可能與WD重復蛋白家族影響氧化應激有關。血脂及凝血功能的異常是IS發生及演變的風險因素，與本研究相似的是，研究發現MRAS多個多態性位點與IS血脂TC水平升高相關〔16〕。此外，我們的研究同樣發現，無論在校正性別年齡前或校正性別年齡后，WDR5B基因rs9843165多態性與IS患者的血漿Hcy水平均顯著相關，相關研究發現LncRNA H19基因多態性與IS的凝血功能及Hcy水平存在統計學關聯，提示該基因多態性可能影響IS患者的凝血功能及Hcy代謝〔17〕。Hcy參與腦缺血后損傷的過程，其介導機制包括氧化應激、血管內皮損傷、炎癥反應等，其已被現代醫學研究證實是IS的危險因子之一〔18，19〕。綜上，WDR5B基因rs9843165多態性可能通過影響患者的血脂、凝血功能及Hcy水平進而影響IS的發生風險。但其具體影響機制需深入研究。