肌萎縮側索硬化SOD1基因多態性與臨床表型分析☆

吳瑞鵬 馮斌 任占宏 谷成高福林 張毅

肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis muscular atrophy，ALS） 分為家族性 ALS （familial amyotrophiclateral sclerosis，FALS）和散發性 ALS（sporadic amyotrophic lateral sclerosis，SALS）。關于ALS的基因組學特征，現階段研究較明確的有銅/鋅超氧化物歧化酶1（Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1）、 反式激活反應-DNA結合蛋白 （TARDBP）基因、C9orf72基因、肉瘤熔合（FUS）基因，占到家族性 ALS的20%，占到散發型ALS的1%[1-2]。與SOD1基因相關的亞型稱為ALS1亞型，目前SOD1基因已經報告了200余種基因突變類型[3]，中國ALS人群中的研究共報告了SOD1基因突變26種[4-8]，國內報告較多的SOD1基因突變H46R 、V47A、G37R、Cys111Tyr和 Gly147Asp，多集中于華北地區及華東地區[9]。甘肅為亞高原，多民族雜居，ALS基因組學有其特征性表現，本研究收集甘肅地區FALS患者家系進行SOD1基因突變檢測，分析SOD1突變患者的臨床特點及突變與臨床表型關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2018年1月至2020年6月收治的18例FALS家系的先證者，男7例，女11例，平均年齡（48.3±12.6）歲。所有病例由至少兩位以上神經內科?？漆t生獨立做出診斷，診斷標準依據EI Escorial修訂診斷標準[10]。排除標準：①有腫瘤疾病史；②有嚴重心腦血管疾病；③精神異常及外傷病史；④有其他家族遺傳病史。所有研究對象簽署知情同意書，本研究得到我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取先證者外周血2 mL，酸性檸檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝后，用 Qiagen試劑盒進行DNA提取，無水乙醇洗滌兩次，-80℃保存。

1.2.2 SOD1基因PCR擴增引物及反應條件

表1 SOD1基因PCR擴增引物及反應條件

1.2.3 DNA序列分析 PCR產物Qiaquick柱純化，采用美國ABI公司生產的3730 DNA自動測序儀進行 DNA序列分析，測序結果與美國國立生物技術信息中心（NCBI）數據庫中心公布的人類基因組SOD1 cDNA序列進行比對。

2 結果

18例先證者中，3例檢測出SOD1陽性，均為雜合突變，其中 2例 p.Gly73Ser突變，1例p.G42D突變，其余15例未檢測出SOD1基因突變，SOD1基因陽性突變檢出率為 16.67%（3/18例）。

2.1 先證者SOD1基因突變的家系分析p.Gly73Ser突變FALS家系臨床資料如下。A（圖 1A）：先證者（Ⅲ6）為 46歲女性，以緩慢進展的右上肢無力為首發癥狀，患者于2017年8月發現右手拇指和食指捏握無力，數月后出現部位不固定的肌束顫動，無疼痛及其他不適感覺，2018年3月，發現右上肢肌肉萎縮，以大魚際肌及三角肌萎縮明顯。期間就診多家醫院，于2019年7月在我院就診，患者出現左手力弱，伴行走時右足活動不靈活，伴有活動后氣短，查體發現右手及上臂肌肉無力、萎縮，錐體束癥狀不明顯。肌電圖提示脊髓頸段、胸段神經源性損害。先證者兩子目前無發病，先證者叔叔（Ⅱ2）于57歲時因呼吸衰竭過世，于45歲時開始出現腿部無力，病情緩慢進展，9年后開始使用輪椅，期間就診多家醫院診斷ALS，發病10余年后因呼吸衰竭行氣管切開輔助呼吸機通氣，半年后過世。先證者父親（Ⅱ4）于63歲時死于結腸癌并腦轉移，當時結腸癌確診5年，已行手術切除，期間無運動神經元病的表現。先證者母親（Ⅱ5）現已 76歲，目前身體健康。B（圖 1B）先證者（Ⅲ3）為50歲女性，4年前發現雙手持物困難，左側重，1年多后出現走路不穩，上下樓梯困難，后逐漸出現左上肢魚際肌、前臂肉跳，無球部癥狀，肌電圖提示廣泛神經源性損害（脊髓頸胸腰段），全脊髓MR無異常。先證者母親（Ⅱ2）病史7年，后因繼發肺部感染過世。先證者叔叔47歲死于車禍傷。

圖1 p.Gly73Ser突變的FALS家系圖（A、B圖）

p.42GD突變FALS家系臨床資料如下。先證者 （Ⅳ1）為45歲女性，病史8年，她在37歲時出現走路搖晃、不穩，之后的4年多病情緩慢進展，42歲時出現雙腿僵硬感，自覺右腿比左腿嚴重，43歲時需手杖行走，44歲時行走需要輪椅，同時出現上肢肌無力伴隨吞咽困難，半年后出現聲音嘶啞、呼吸急促，伴弓形足及肌束震顫，全脊髓MR、血液、腦脊液檢查均無異常。肌電圖顯示神經源性改變。先證者母親（Ⅲ1）健康，父親（Ⅲ2）因30多年的單側下肢肌萎縮，一直未明確診斷，其基因型為p.G42D雜合突變。家族史中的一位叔叔（Ⅲ3）于70歲時死于散發ALS。其弟（Ⅳ3）發育遲緩，其小姨（Ⅲ10）和表弟（Ⅳ4）診斷為遺傳性痙攣性截癱（圖2）。

圖2 p.G42D突變的FALS家系圖

2.2 SOD1基因突變結果

圖3 對先證者應用NGS+PCR-Sanger測序法對SOD1基因5個外顯子和側翼序列的突變篩查發現，突變位于3號外顯子的雜合突變，cDNA在217位堿基由G突變為A，使第73位氨基酸由甘氨酸變為絲氨酸，如圖3。

圖3 SOD1基因外顯子3的 p.Gly73Ser（c.217G＞A）雜合變異

圖4 對先證者應用NGS+Sanger測序法對SOD1基因5個外顯子和側翼序列的突變篩查發現，突變位于2號外顯子的雜合突變，cDNA在125位堿基由G突變為A，使第42位氨基酸由甘氨酸變為天冬氨酸，如圖4：p.G42D（c.125G＞A）。

圖4 SOD1基因外顯子2的 p.G42D（c.125G＞A）雜合變異

3 討論

ALS是一種累及上下運動神經元的慢性退行性疾病，臨床表現肌肉無力萎縮，椎體束征等，疾病后期出現嚴重的肌肉萎縮、延髓麻痹，最終多因呼吸衰竭或繼發肺部感染死亡。目前病因、病理機制仍不明確，針對病因的研究多集中在興奮性氨基酸毒性、自由基蓄積、遺傳機制等，遺傳機制目前得到廣泛認可。在ALS中約有10%FALS，大多數FALS為常染色體顯性遺傳，目前已有30多個基因與FALS相關，SOD1的突變率國外報告僅有20%[11]，本研究中18例先證者中，SOD1陽性概率僅為16.67%，與陳嬿等[6]報告的23.06%、張華綱等[7]報告的23.3%較低，提示SOD1基因在甘肅地區FASL患者中陽性率偏低。本研究中共收集FALS患者18例，漢族占15例，回族占1例，東鄉族 1例，藏族1例，仍以漢族為主要發病群體，少數民族占16.67%，漢族仍是FALS發病的主要群體。SOD1基因蛋白是一種自由基清除酶，在神經組織、紅細胞及肝臟中呈現高表達，具有抗氧化作用。目前認為SOD1基因突變導致蛋白毒性功能的獲得是SOD1基因的致病機制[8]，種族差異對SOD基因突變的影響目前國內尚無文獻報告。我們猜測甘肅地區雖為亞高原地區，多民族雜居，除飲食結構有差異外，環境、物理因素、生活習慣均被漢化，因此種族差異對基因影響較小。

本研究中p.Gly73Ser突變的臨床表型：先證者以肢體無力起病，以下運動神經元損害為主，病情進展緩慢，最終導致呼吸衰竭，病史達10年之久。ORRELL等[12]在一個ALS家系中檢出 SOD1基因 Gly72Ser（同 p.Gly73Ser）雜合突變，紅細胞檢測結果顯示SOD1酶活性降低45%，SHAW等[13]在1例ALS患者中檢出SOD1基因Gly72Ser突變，此患者以下肢痙攣無力起病，最終呼吸衰竭，病程2年。這一類型臨床表現以下肢起病，上運動神經元損害不明顯，易誤診為周圍神經病變，且目前國內尚無此突變基因的報告。p.G42D突變發病年齡較小，30多歲起病，病情進展緩慢甚至處于相對靜止狀態，以下肢起病為主，病史長達30年。由于先證者父系和母系可能存在交叉影響，導致先證者弟弟幼年時期出現智力低下，具體基因型尚不明。

目前在人類基因庫中報告了200多個SOD1基因突變，其臨床表現多樣化，從急性進展性到緩慢演變，其進展方式也各有不同[14]。本研究對甘肅地區18個FALS家系篩查SOD1基因突變，檢出Gly72Ser和p.G42D兩種突變，這一結果擴大了中國FALS患者的SOD1基因突變譜。同時通過對SOD1基因突變與臨床表型關系的探討，為更準確診斷FALS及判斷預后提供依據，也為ALS患者及其親屬提供基因學的遺傳咨詢。