LC-ESI-MS/MS法測定清開靈注射液中5種有效成分的含量

龍凱，王娟，彭建彪（云南省紅河州食品藥品檢驗所，云南 蒙自 661199）

清開靈注射液主要由豬去氧膽酸、膽酸、梔子、黃芩苷、金銀花等8 味中藥制成，具有清熱化痰、醒神開竅的功效，多用于熱病、神昏、上呼吸道感染、肺炎證候者。豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸為其主要有效成分，《中國藥典》2020年版一部中收載了該品種豬去氧膽酸、膽酸、梔子、黃芩苷含量測定的HPLC 方法[1]，但需用兩種不同的檢測器分別進行測定，主色譜峰出峰時間較長，原質量標準未制訂金銀花含量測定的項目，沒有進行全面質量控制。目前尚無同時測定該劑型5 種成分含量的相關報道[2-4]，日常質量檢測工作中操作繁瑣費時，為簡化檢測方法，研究采用LC-ESI-MS/MS 法同時測定清開靈注射液中5 種成分的含量。

1 儀器及試藥

Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific）；AB SCIEX QTRAP4500三重四極桿質譜儀（AB SCIEX 公司）；Sartorius BP211D 電子天平（德國賽多利斯）。豬去氧膽酸（批號：100087-201411，含量：99.7%）、膽酸（批號：100078-201415，含量：98.9%）、梔子苷（批號：110749-201919，含量：97.1%）、黃芩苷（批號：110715-201821，含量：95.4%）、綠原酸（批號：110753-202018，含量：96.1%），（對照品中國食品藥品檢定研究院）；清開靈注射液（吉林省集安益盛藥業股份有限公司，規格：10 mL/支，批號：20011803、20021901、20041505、20030601、20042801、20061102）；甲醇（色譜純，霍尼韋爾貿易上海有限公司）；水為超純水；其余試劑均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5 Super C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動相：甲醇（A）-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～3.0 min，5%A；3.0～4.0 min，5%～100%A；4.0～8.0 min，100%A；8.0～9.0 min，100%～5%A；9.0～10.0 min，5%A）；流速：0.4 mL·min－1；進樣量：2 μL：柱溫：40℃。

2.1.2 質譜條件 離子源：ESI；檢測方式：正負離子切換模式；掃描方式：多反應離子監測（MRM）；離子化電壓：正負離子模式均為4500 V；干燥氣（N2）溫度：500 ℃；噴霧氣（N2）壓力：50 psi；5 種成分質譜參數[5-7]見表1。

表1 質譜參數Tab 1 Mass spectrum parameters

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸對照品適量，置25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含豬去氧膽酸372 μg、膽酸361 μg、梔子苷94 μg、黃芩苷563 μg、綠原酸55 μg 的混合對照品溶液（均按純度折算）。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液（甲醇），按“2.1” 項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖1，圖中可見空白溶液在豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸相應保留時間處無干擾峰。

圖1 清開靈注射液多反應監測（MRM）色譜圖Fig 1 MRM chromatogram of Qingkailing injection

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為系列混合對照品溶液，各精密吸取2 μL 進行測定，記錄峰面積，以對照品溶液質量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，結果見表2。

表2 線性關系考察、檢測限和定量限Tab 2 Linearity，limit of detection and limit of quantization

2.3.3 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項下分析條件連續進樣6 次，豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.99%、0.93%、0.83%、0.77%、1.0%（n＝6）。間隔24 h 取同一混合對照品溶液在相同分析條件下再連續進樣6 次，5 種成分峰面積RSD分別為1.0%、0.99%、0.90%、0.85%、1.1%（n＝12）。結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下分析條件分別于0、1、2、4、8、12、24 h 測定，結果豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸峰面積的RSD分別為1.1%、1.1%、1.2%、1.0%、1.3%（n＝7），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取批號20011803 的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下條件測定，計算樣品中豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的平均含量分別為3.11、3.21、0.55、5.25、0.36 mg·mL－1，RSD分別為1.1%、1.1%、1.3%、1.0%、1.3%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.6 檢測限和定量限 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項下分析條件測定，以信噪比（S/N）約為3 和10 時分別計算豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的檢測限和定量限，結果見表2。

2.3.7 加樣回收試驗 精密量取已知含量的樣品（批號：20011803）1 mL 置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋定容，取1 mL 置100 mL 量瓶，共6 份，分別精密加入“2.2.1”項下混合對照品溶液1.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，進樣測定，計算加樣回收率，平均加樣回收率分別為99.6%、99.4%、98.5%、99.8%、98.7%；RSD分別為1.1%、0.98%、1.5%、0.83%、2.0%（n＝6）。

2.4 樣品含量測定

取清開靈注射液樣品6 批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，計算豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(n＝2，mg·mL－1)Tab 3 Content determination of samples (n＝2，mg·mL－1)

3 討論

曾用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相體系，結果黃芩苷峰形拖尾嚴重，響應值低。而使用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液作為流動相時黃芩苷峰形較好，響應值穩定且更高，因此本方法采用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液作為流動相。

在正、負離子模式同時掃描時，黃芩苷和綠原酸在兩種模式下均有明顯的響應值，黃芩苷在正離子模式下響應值更高，而綠原酸在負離子模式下響應值更高。豬去氧膽酸分子量為392.6，[M-H]－離子為m/z391.6，使用質譜對其進行掃描，未發現其特征性的子離子碎片，參考文獻[8]選擇m/z391.6→391.6 作為豬去氧膽酸的檢測離子對，并得到了良好的色譜峰和響應值。

批號20041505 與批號20030601 的樣品綠原酸含量測定結果相差較大，可能是由于金銀花不同產地、不同季節、不同批次所含綠原酸量差異所導致。

本方法可以在較短時間內同時測定豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的含量，色譜分離效果好，具有高靈敏度、高專屬性、準確、穩定的特點，相較高效液相色譜法在定性定量方面更為準確，為清開靈注射液5 種主要成分含量的分析提供了便捷有效的質控方案。