大葉千斤拔的質量標準研究

鄭元青，何風艷，張鵬，龔云*（.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 4000；.中國食品藥品檢定研究院，北京 00050）

千斤拔始載于《植物名實圖考》，其性味甘、溫，具有祛風濕、益脾腎，強筋骨之功效，主要用于治療風濕骨痛、腰肌勞損、月經不調、痛經和白帶多等婦科疾病[1-2]。2015年版《中國藥典》四部收載其植物來源包含蔓性千斤拔Moghaniaphilippinessis（Merr.et Rolfe）Li、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze 和繡毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li的干燥根[3]，其中繡毛千斤拔在國內分布較少，且未形成大宗商品[4]。在2009年版《湖南省中藥材標準》中收載了千斤拔（蔓性千斤拔）FlenmingiaphilippinessisMerr.et Rolfe 的干燥根和大葉千斤拔F.macrophylla（Willd.）Prain 的干燥根和莖[5]，是中藥材千斤拔的主要來源。按照一品一標的原則，本文對大葉千斤拔的性狀、鑒別、檢查、含量等質量情況進行深入研究。

婦科千金片/膠囊是千金藥業自主開發并獨家生產的純中藥制劑，占有婦科炎癥類口服中成藥20%的市場份額，其中千斤拔為其君藥。黃酮類化合物是千斤拔中所含的主要成分類型[6-9]，代表性成分為染料木苷（genistin）和染料木素（genistein），兩者均具有較強的抗氧化、類激素、抗菌、抗癌和保護心血管等主要作用[10-17]。千斤拔作為中成藥婦科千金片、婦科千金膠囊、金雞膠囊等的君藥，在治療婦科疾病和風濕病方面正是這類化學成分起著類激素作用和抗炎、抗氧化作用。因此，本文在湖南省地方標準的基礎上，以婦科千金片/膠囊中的君藥大葉千斤拔為研究對象，新增以染料木苷為對照品的薄層色譜（TLC）及高效液相色譜（HPLC）定性和定量檢測方法，補充安全性評價指標，從建立性狀、顯微鑒別、薄層色譜、水分、總灰分、有機氯農藥殘留、重金屬及有害物質、黃曲霉毒素、浸出物、特征圖譜和含量測定各項研究方法，為大葉千斤拔的標準化建設提供基礎，為保障千斤拔藥材質量提供依據。

1 材料

1.1 儀器

e2695 高效液相色譜儀（Waters），Agilent 1260-6410B LC-MS 聯用系統（Agilent），Mettler AE240、Mettler XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多），KQ-300DA 型醫用數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz），TGL-16G 離心機（上海安亭科學儀器廠）；CAMAG Linomat V 半自動點樣儀、CAMAGReprostar 3 薄層色譜數碼成像系統（瑞士瑪卡）。BX43 型生物顯微鏡（日本 Olympus 公司）；DHG-9140A 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器公司）；SX2-4-10 型電阻爐（長沙市華光電爐廠）；iCAPRQ 電感耦合等離子體質譜儀（美國熱電公司）；AFS830a 原子熒光光譜儀（中國吉天公司）。

1.2 試藥

染料木苷對照品（批號：111709-201702，含量以99.9%計）及蔓性千斤拔對照藥材（批號：121502-200802）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙酸（分析純）、聚酰胺薄膜（國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、冰醋酸（色譜純，Fisher公司）；水為ddH2O。

藥材均經千金藥業QC 主管丁小明鑒定，其中大葉千斤拔[Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze]15 批，蔓性千斤拔[Moghania philippinessisMerr.et Rolfe Li]1 批，繡毛千斤拔[Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li]1批，山豆根（Sophoratonkinensis Gagnep）1 批，藥用部位均為根（見表1）。

表1 樣品來源Tab 1 Sample source

2 方法與結果

2.1 大葉千斤拔根的性狀

根據樣品實際情況并參照各地方標準描述，根有多數分支，根頭部常呈結節狀膨大，長5～10 cm，直徑0.5～8.0 cm；表面灰棕色或紅棕色，有細縱紋及橫長皮孔樣斑痕；質硬，不易折斷；切面皮部薄，棕紅色；木部淡紅色，具放射狀紋理；微具豆腥氣，味微甘澀。

圖1 大葉千斤拔根Fig 1 Roots of Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze

2.2 根橫切面顯微特征

大葉千斤拔根橫切面特征如下：

① 木栓層由數列木栓細胞組成。② 皮層具數列橢圓形薄壁細胞。③ 韌皮部纖維成束或散在，壁厚，微木化；分泌細胞單個散在或數個成群存在，內含黃棕色或紅棕色物；韌皮射線明顯。④ 形成層明顯。⑤ 木質部導管單個散在或數個相連，徑向排列；木纖維成片，壁厚，木化；木射線寬1～5 列細胞；薄壁細胞內含草酸鈣方晶、淀粉粒和黃棕色物。具體見圖2。

圖2 根橫切面特征圖Fig 2 Microscopic characteristics of roots

2.3 TLC 鑒別

取樣品粗粉約1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，過濾，取濾液，作為供試品。另取染料木苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 的溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗，吸取對照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以36%乙酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，熱風加熱1 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果顯示，供試品色譜在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且大葉千斤拔與偽品山豆根的色譜有明顯區別，詳見圖3。

圖3 千斤拔薄層色譜圖Fig 3 TLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.4 水分

按 2015年版《中國藥典》四部水分測定法[3]項下方法測定樣品水分。結果表明，15 批樣品水分在 8.02%～9.72%（見表2），故擬訂大葉千斤拔含水分不得過 12%。

表2 大葉千斤拔各項指標測定結果Tab 2 Determination of Moghania macrophylla

2.5 總灰分

按 2015年版《中國藥典》四部總灰分測定法[3]測定樣品灰分。結果表明，15 批樣品總灰分在1.67%～4.68%（見表2），故擬訂大葉總灰分不得過 6.0%。

2.6 浸出物

按 2015年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法[3]測定樣品浸出物。結果表明，15 批樣品浸出物在 8.76%～16.33%（見表2），均值下浮 20%為10.3%，故擬訂大葉千斤拔浸出物不得少于10%。

2.7 重金屬及有害物質

按照2015年版《中國藥典》四部鉛、鎘、砷、汞、銅的測定法[3]測定樣品重金屬及有害物質。結果表明，15 批樣品鉛在0.24%～0.94%，鎘在0.023%～0.060%，砷在0.10%～0.14%，汞在0.0024%～0.0052%，銅在3.37%～6.40%。參考2015年版《中國藥典》一部甘草、白芍、西洋參等品種項下的相關規定，擬訂大葉千斤拔重金屬及有害物質的限度：鉛不得過5 mg·kg－1，鎘不得過1 mg·kg－1，砷不得過2 mg·kg－1，汞不得過0.2 mg·kg－1，銅不得過20 mg·kg－1。

2.8 有機氯類農藥殘留

按照2015年版《中國藥典》四部農藥殘留量測定法項下第一法[3]測定樣品有機氯類農業殘留。結果表明，15 批樣品總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯均為0。

2.9 黃曲霉毒素

按照2015年版《中國藥典》四部黃曲霉毒素測定法項下的第二法[3]測定樣品。結果表明，15批樣品黃曲霉毒素濃度在0～3.79 μg·kg－1。參考2015年版《中國藥典》一部大棗、肉豆蔻等品種項下的相關規定，擬訂大葉千斤拔黃曲霉毒素的限度：每1000 g 含黃曲霉毒素B1不得過5 μg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1總量不得過10 μg。

2.10 含量測定

2.10.1 對照品溶液的制備 取染料木苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL 含染料木苷46 μg 的溶液，即得。

2.10.2 供試品溶液的制備 取樣品，粉碎，過三號篩，稱取粉末約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，補重，搖勻，6000 r·min－1離心10 min，取上清液經0.45 μm 濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.10.3 色譜條件 采用 Agilent Zorbax SBphenyl 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.5% 乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%→20%A；20～40 min，20%→30%A；40～60 min，30%→50%A；60～80 min，50%→70%A；80～90 min，70%→90%A），流速1.0 mL·min－1，柱溫 30 ℃，檢測波長260 nm。理論板數按染料木苷峰計算應不低于3000。

2.10.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。典型色譜圖見圖4。

圖4 千斤拔高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.10.5 方法學驗證

① 線性關系考察：取染料木苷對照品溶液，分別配制成5、10、20、40、64、80 μg·mL－1，進樣體積為10 μL，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線并進行線性回歸，線性范圍0.05～0.80 ng，回歸方程Y＝6×106X－2.679×104，相關系數0.9999，表明線性關系良好。

② 精密度試驗：取“2.10.1”項下對照品溶液連續進樣6 次，染料木苷峰面積的RSD為0.5%，表明方法精密度良好。

③ 穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h 進樣測定峰面積，染料木苷峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

④ 重復性試驗：分別精密稱取同一千斤拔樣品6 份，按“2.10.2”項下方法制備供試品溶液，測得染料木苷平均含量為1.30 mg·g－1，RSD為2.0%，表明方法重復性良好。

⑤ 加樣回收試驗：精密稱取已知成分含量的千斤拔樣品0.5 g，精密加入0.02 mg·mL－1染料木苷對照品溶液25 mL，按“2.10.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，結果染料木苷的平均回收率分別為96.7%，RSD為1.3%，符合要求。

⑥ 耐用性試驗：取同一供試品溶液，采用3種高效液相色譜儀、3 根不同品牌的苯基柱進行測定，染料木苷含量的RSD為1.5%，表明方法的耐用性較好。

2.10.6 樣品測定 取15 批樣品各適量，參照文獻方法[18]檢測樣品含量。結果染料木苷的平均含量為 0.06%，以該值下調 20%則為 0.048%，故擬訂本品含染料木苷含量不得少于 0.04%。

3 討論

目前，千斤拔藥材的質量標準未收錄至《中國藥典》，在云南、廣西、湖南等省的地方標準中僅體現為性狀、鑒別、浸出物等檢查項。本文在此基礎上新增含量、重金屬及有害物質、黃曲霉、有機氯農藥殘留的研究，為其質量標準提升提供數據支撐；在現有地方標準中薄層鑒別方法多使用千斤拔對照藥材（蔓性千斤拔）或者羽扇豆醇對照品，本文新建以染料木苷為對照的大葉千斤拔的薄層鑒別方法，使其能有效的區別同為豆科的山豆根（混淆品），增強了方法專屬性。在薄層色譜方法中筆者對比了G254 薄層板和聚酰胺薄層板，對照物質考察了千斤拔對照藥材、染料木苷、染料木素，發現聚酰胺薄層板的斑點更加清晰，分離效果更好；大葉千斤拔與對照藥材兩者在固定相上區別較為明顯，主斑點數及顏色都有差異；染料木素和染料木苷兩個成分極性相差較大，同時在薄層板上作為對照品的效果不理想，而染料木素的分離效果不如染料木苷。最終條件選擇了聚酰胺薄層板，以染料木苷為對照，以36%乙酸為展開劑建立檢測方法，條件簡單，易于操作。

考察了不同的提取方式、提取溶劑和提取時間對色譜圖的影響。結果表明染料木苷色譜峰受提取方式的影響較大。6''-O-丙二酰染料木苷對熱不穩定[19]，加熱時會轉化為染料木苷，因此，本研究選擇超聲提取的方式以避免加熱導致6''-O-丙二酰染料木苷轉化。3 種溶劑中70%甲醇的提取效率最優，而30 min 與60 min 的提取效果相近，最終選擇70%甲醇超聲提取30 min。

大葉千斤拔的主要成分包括糖類、苷類、黃酮類、鞣質、酚類、氨基酸、甾體、皂苷、有機酸、生物堿、揮發油、蒽醌類化合物等[20]，其中染料木苷成分藥理作用豐富，是含量較高的黃酮類成分，且保留時間靠前，分離度、色譜峰純度等方面均符合含量測定要求，故選定染料木苷作為大葉千斤拔藥材含量測定的指標。