潰瘍油高效液相色譜特征圖譜研究及5種成分的含量測定

韓鋒，肖宏華*，胡妍文，馬秉智，劉開玉（.北京市朝陽區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 004；.中日友好醫(yī)院，北京 0009）

潰瘍油為中藥復(fù)方制劑，處方由大黃、白芷、川芎組成，臨床用于熱毒蘊結(jié)于肌膚所致的疥瘡、潰瘍等癥，具有活血生肌、消腫止痛的功能。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，通過薄層色譜法進行定性鑒別，樣品用量大，提取方法較為繁瑣。目前，針對該制劑質(zhì)量分析方法的研究報道較少，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文參考相關(guān)文獻[4-6]，采用HPLC-DAD 法建立潰瘍油的特征圖譜，對該制劑所含多種化學(xué)成分進行分析，并對其中歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的含量進行測定，為其質(zhì)量評價及控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260，DAD 檢測器，二元泵，ChemStation 工作站）；電子天平（XS-205 DU，十萬分之一，METTLER-TOLEDO）；純水/超純水系統(tǒng)（明澈TM-D 24 UV，Merck Millipore）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

藥材大黃（批號：121249-201304）、川芎（批號：120918-201612）、白芷（批號：120945-201510）（中國食品藥品檢定研究院），對照品歐前胡素（批號：110826-201918，含量以99.0%計）、藁本內(nèi)酯（批號：111737-201608，含量以86.9%計）、異歐前胡素（批號：110827-201611，含量以99.4%計）、大黃素（批號：110756-201512，含量以98.7%計）、大黃酚（批號：110796-201922，含量以99.4%計）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（HPLC，F(xiàn)isher Chemical）；磷酸（HPLC，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；超純水（自制）；花生油（批號：20190923，嘉里糧油青島有限公司）。

按潰瘍油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法制備10 批樣品，處方中大黃、白芷、川芎各10 批均為市售，經(jīng)本中心肖宏華副主任藥師鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部的要求。市售潰瘍油5 批（廠家A：20180403、20191205、20200324、20200401；廠家B：20200106）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇（A）、0.2%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～15 min，60%A；15～25 min，60%～100%A；25～37 min，100%A）；檢測波長254 nm；光譜范圍：190～400 nm，流速1.0 mL·min－1；步進值1.0 nm；柱溫40℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含歐前胡素51.09 μg、藁本內(nèi)酯82.90 μg、異歐前胡素10.30μg、大黃素10.56 μg、大黃酚21.35 μg 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取潰瘍油樣品，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）20 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，－18℃冷藏2 h，取上清液用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 藥材及陰性樣品溶液 按照潰瘍油處方及工藝，制備大黃、白芷、川芎藥材及相應(yīng)的陰性樣品，以及花生油陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備相應(yīng)陰性樣品溶液。

2.3 潰瘍油HPLC 特征圖譜研究

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次。以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.020%～0.080%，相對峰面積的RSD為0.15%～1.7%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明該檢測系統(tǒng)具有良好的精密度。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一潰瘍油樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.020%～0.11%，相對峰面積的RSD為0.32%～1.7%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h 按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰6（歐前胡素）為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.020%～0.23%，相對峰面積的RSD為0.18%～1.6%，相似度均大于0.99，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 特征圖譜的建立 取10 批潰瘍油，分別進行HPLC 檢測，將得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”進行數(shù)據(jù)分析，計算相似度，建立對照圖譜，見圖1和圖2。結(jié)果顯示各批圖譜與對照圖譜之間相似度均大于0.94，見表1。并確定13 個共有峰，其中峰6（歐前胡素）分離度良好，保留時間和峰面積適中，且其相對穩(wěn)定，故選定峰6（歐前胡素）為參照峰（S）。

圖1 對照HPLC 特征圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of reference

圖2 10 批潰瘍油HPLC 圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of 10 batches of Kuiyang oil

表1 10 批潰瘍油相似度分析結(jié)果Tab 1 Similarity of 10 batches of Kuiyang oil

2.3.5 特征峰的藥味歸屬 取“2.2.3”項下大黃、白芷、川芎藥材溶液及相應(yīng)的陰性樣品溶液，進行HPLC 檢測，通過色譜峰保留時間及DAD 光譜圖對潰瘍油樣品色譜中的特征峰進行藥味歸屬，利用對照品進行成分確認。結(jié)果峰1 來源于輔料花生油，峰2、3、6（歐前胡素）、8、10（異歐前胡素）來源于白芷，峰4、7（藁本內(nèi)酯）、9來源于川芎，峰5、11（大黃素）、12（大黃酚）、13 來源于大黃，見圖3。

2.3.6 樣品測定 取市售潰瘍油5 批進行檢測，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”進行數(shù)據(jù)分析，并通過與特征峰的相對保留時間和光譜圖比對，除20180403 樣品（其中2、3、4、7、13 色譜峰低于檢出限）外，各批色譜數(shù)據(jù)與對照特征圖譜的相似度在0.85 以上，均檢出與對照特征圖譜相對應(yīng)的13 個特征峰，表明本文建立的特征圖譜具有良好的適用性，見圖4。

圖4 5 批市售潰瘍油與對照HPLC 圖譜Fig 4 HPLC chromatogram of 5 batches of Kuiyang oil and reference

2.4 潰瘍油中5 個成分的含量測定

2.4.1 專屬性考察 分別取供試品、對照品、陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測。結(jié)果顯示在供試品色譜中待測成分與其他成分分離度大于1.5，各陰性樣品色譜中分別在歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚色譜峰相應(yīng)保留時間處，無相對應(yīng)的色譜峰，表明各陰性樣品與待測成分之間無干擾，色譜圖見圖3。通過色譜數(shù)據(jù)處理軟件（AgilentChemStation）的光譜功能，對各色譜峰進行純度檢測，純度因子均大于993，供試品中的待測成分色譜峰的光譜圖與各對照品色譜峰的光譜圖一致，表明該方法專屬性良好。

圖3 樣品、對照品、單味藥材、各陰性樣品的HPLC 圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of sample，reference substance，single medicinal and negative samples

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項下對照品混合溶液0.4、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。將上述8 個質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品量（ng）為橫坐標(biāo)（X），進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系Tab 2 Linearity

2.4.3 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，測得歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.1%、0.77%、0.93%、1.1%、1.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的峰面積RSD分別為1.0%、1.0%、0.71%、1.7%、1.3%，結(jié)果表明供試品溶液中上述5 個成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一樣品按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的含量，RSD分別為2.4%、1.4%、2.9%、2.4%、2.3%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 精密量取混合對照品溶液5 mL，置具塞錐形瓶中，減壓揮干溶劑，加入已知含量的樣品（批號：20191205）1 g，混勻，制備6 份，按“2.2.2”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果歐前胡素、藁本內(nèi)酯、異歐前胡素、大黃素、大黃酚的平均加樣回收率（n＝6）分別為94.2%（RSD＝0.86%）、91.0%（RSD＝1.9%）、109.8%（RSD＝1.0%）、102.7%（RSD＝2.8%）、99.2%（RSD＝2.1%），回收率符合要求。

2.4.7 樣品含量測定 分別取廠家A 潰瘍油4 批及廠家B 潰瘍油1 批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，用外標(biāo)法計算，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(μg·g－1，n＝3)Tab 3 Samples determination (μg·g－1，n＝3)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

通過文獻[2-3]可知歐前胡素、異歐前胡素為白芷的有效指標(biāo)成分，藁本內(nèi)酯為川芎的有效指標(biāo)成分，大黃素、大黃酚為大黃的有效指標(biāo)成分，均具有專屬性，故對潰瘍油中上述5 種成分進行質(zhì)量控制。

3.2 色譜條件的選擇

通過文獻[7-10]分析，選擇乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等作為流動相進行考察，并進行了比例優(yōu)化，結(jié)果表明甲醇-0.2%磷酸溶液作為流動相通過梯度洗脫，所得色譜峰峰形較好，保留時間和峰面積較穩(wěn)定。通過光譜分析，各成分最大吸收波長分別為歐前胡素（248、302 nm）、藁本內(nèi)酯（280、330 nm）、異歐前胡素（250、312 nm）、大黃素（290 nm，并在240～280 nm 處有寬幅吸收）、大黃酚（257 nm），以上5 個成分均在254 nm 處有較大的紫外吸收，且基線平穩(wěn)，無其他成分干擾。考察了Waters XBridge、Waters Sunfire 與Phenomenex C18色譜柱及柱溫（30、35、40 ℃），結(jié)果表明Waters XBridge C18色譜柱，柱溫40℃的分離效果最好。

3.3 提取方法的選擇

考察了乙腈、甲醇作為提取溶劑，在相同條件下所得檢測結(jié)果無明顯差異，從溶劑的性質(zhì)及成本考慮，最終選擇甲醇作為提取溶劑。考察了回流提取和超聲提取，在相同條件下檢測結(jié)果無明顯差異，從操作簡便考慮，最終選擇超聲提取。并對提取時間（15、20、40、60 min）、溶劑用量（10、20、25 mL）進行了考察，結(jié)果表明溶劑用量20 mL、超聲提取20 min 為最優(yōu)提取條件。

3.4 樣品含量測定結(jié)果

市售5 批樣品中，各批次間的峰面積有一定差異（RSD為16.0%～48.9%），反映出各化學(xué)成分含量的差異性。這些差異可能來自于原料，也可能是貯存條件造成的。樣品20180403 的圖譜中，變化較大的4 號峰和7 號峰均來自于川芎，其中7 號峰對應(yīng)的藁本內(nèi)酯變化最大。對藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性研究表明，室溫（18～25℃）避光條件下放置6 個月后，川芎揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分數(shù)由初始的59.89%降至18.10%[11]，因此樣品20180403中藁本內(nèi)酯的含量低于定量限，可能是由于貯存時間較長或溫度偏高造成。另外，樣品20180403、20191205 在保留時間29～35 min 處的色譜峰較其他樣品有較大差異，可能受制備工藝、貯存條件等因素的影響，后續(xù)需要收集更多樣品進一步研究。

3.5 結(jié)論

綜上所述，本文建立的潰瘍油HPLC 特征圖譜方法和對有效成分的含量測定方法，不僅可以對該制劑中化學(xué)成分進行量化分析和質(zhì)量評價，也可以為原料的篩選、制備工藝的優(yōu)化、貯存穩(wěn)定性的考察等方面提供參考。