新加香薷飲揮發油氣相色譜指紋圖譜研究

鑒志剛，葉世蕓*，李向東，王敏（.貴州中醫藥大學，貴陽 55000；.貴州得軒堂護康藥業股份有限公司，貴陽 550008）

新加香薷飲記載于清代醫家吳鞠通所著《溫病條辯》[1]，由香薷（二錢）、銀花（三錢）、鮮扁豆花（三錢）、厚樸（二錢）、連翹（二錢）等5 味中藥組成，香薷發汗解表，和中利濕，有“夏月麻黃”之稱，為夏月解表祛暑要藥，金銀花、連翹均味辛涼而質輕清，有輕以去實，清熱解毒之功；白扁豆花能健脾化濕以和中，辛涼宣散，增強香薷清透暑熱之力；厚樸苦辛性溫，燥濕化滯，行氣消悶，助香薷理氣化濕。諸藥相合，共奏祛暑解表，清熱化濕之功。臨床應用主要集中在夏季暑濕型感冒、發熱、中暑等疾病[2-4]，是用于祛濕解表的經典名方，已經收錄于國家中醫藥管理局2018 發布的《古代經典名方目錄（第一批）》中。

近幾年來，國家連續發布關于經典名方的相關政策，質量控制方面要求更加嚴格，而指紋圖譜是中藥質量控制方面常用重要手段[5]，目前新加香薷飲相關報道多集中在其臨床應用方面，在質量控制方面僅謝佳佳等[6]建立了新加香薷飲標準湯劑的HPLC指紋圖譜，可見相關研究薄弱，同時缺少對方中揮發性成分的相關研究，無法全面地對新加香薷飲進行質量評價，方中多種藥材含有揮發性成分，如香薷中麝香草酚、香荊芥酚是2020年版《中國藥典》控制香薷質量的指標性成分[7]，故本研究采用GC 法對16 批新加香薷飲的揮發性成分進行指紋圖譜研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890 氣相色譜儀及Agilent HP-5 毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）（美國安捷倫公司）；DZTW 調溫電熱套（北京市永光明醫療儀器有限公司）；電子天平（十萬分之一）（杭州友恒稱重設備有限公司）。

1.2 試藥

對照品麝香草酚（批號：C100179-191125，純度≥98.00%）、香荊芥酚（批號：C102093-201028，純度≥99.00%）、α-蒎烯（批號：GZDD0228-201217，純度≥99.00%）、β-蒎烯（批號：C101512-201109，純度≥99.00%）（貴州迪大科技有限責任公司）；乙酸乙酯（天津富宇精細化工有限公司，分析純）。各藥材均購自其道地產區或主產區，其來源見表1，均經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法與結果

2.1 色譜條件

HP-5 毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；FID 檢測器；檢測器溫度240℃；進樣口溫度240℃；程序升溫，以40℃為起始溫度，保持2 min，以5℃·min－1升至70℃，以0.5℃·min－1升至74℃，以5℃·min－1升至110℃，以10℃·min－1升至230℃，并保持9.8 min；載氣為氮氣（＞99.99%）；柱流量為2.0 mL·min－1；分流比為20∶1；進樣量為1 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量于5 mL 量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

在Excel 表格中用RAND 函數將各藥材不同批次隨機排序得到16 個隨機組合，編號見表1。照表1組合，按1 錢＝3.73 g，分別稱量香薷、厚樸、連翹各7.46 g，金銀花及扁豆花各11.19 g，加水浸泡30 min，照2020年版《中國藥典》四部通則2204 揮發油測定法甲法操作，于測定器上端加水使之充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯5 mL，加熱回流2 h，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，精密量取續濾液1 mL，即得。

2.4 組方中各藥揮發油制備

分別稱取組方中各味藥材，按“2.3”項下方法制備各單藥的揮發油乙酸乙酯溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取新加香薷飲供試品溶液、空白溶劑（乙酸乙酯），按“2.1”項下色譜條件分別進樣，理論塔板數按麝香草酚計算不少于10 000，各色譜峰分離度良好且拖尾因子在0.95～1.05，表明該方法的專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗 取“2.3”項下同一批次（S16）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，13 號色譜峰峰形及分離度良好，峰面積較大且穩定，故以13 號色譜峰為參比峰，測得各共有峰的相對保留時間的RSD（n＝6）為0.0017%～0.16%，相對峰面積的RSD（n＝6）為0.027%～1.2%，說明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 取“2.3”項下同一批次（S16）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24 h 進樣，以13 號色譜峰為參比峰，測得各共有峰相對保留時間的RSD（n＝6）為0.0017%～0.17%，相對峰面積的RSD（n＝6）為0.025%～2.0%，說明該供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批次藥材按“2.3”項下方法，制成供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件依次進樣，以13 號色譜峰為參比峰，測得各共有峰相對保留時間的RSD（n＝6）為0.031%～0.19%，相對峰面積的RSD（n＝6）為0.024%～2.7%，說明該方法重復性良好。

2.6 GC 指紋圖譜共有模式的建立與分析

將不同批次的供試品依次進樣并記錄色譜圖，并將數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012.130723 版）》，寬度為0.1 min，采用中位數方法，由于溶劑峰太大，影響后續相似度計算結果，且37 min 后無色譜峰，故選取了3～40 min 間色譜圖進行色譜峰匹配處理，生成新加香薷飲GC 指紋圖譜共有模式，見圖1，記錄16 批供試品的指紋圖譜并生成色譜疊加圖，見圖2，并對16 批樣品圖譜進行相似度計算，相似度評價結果見表2。以參比峰的保留時間和峰面積為1，計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中參比峰的保留時間和保留峰面積的比值，見表3及表4。

表2 16 批新加香薷飲相似度評價結果Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表3 16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab 3 Relative retention time of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表4 16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 4 Relative peak area of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

圖1 新加香薷飲GC 指紋圖譜共有模式Fig 1 Common mode of GC fingerprints of Xinjia Xiangru decoction

圖2 16 批次新加香薷飲GC 指紋圖譜Fig 2 GC fingerprints of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

結果顯示16 批新加香薷飲GC 指紋圖譜的共有峰相對保留時間RSD均小于0.18%，說明各共有峰重現性好，各批次間成分差異較小；但共有峰相對峰面積的RSD較大，說明不同批次新加香薷飲各成分含量存在一定差異，產地對各成分含量存在一定影響。通過對相似度評價結果分析發現16 批樣品中S14、S4、S10、S1、S2 相似度均低于0.90，說明不同批次新加香薷飲指紋圖譜中各共有峰的峰面積存在一定差異。

2.7 GC 指紋圖譜中共有峰指認及歸屬

取“2.2”項下混合對照品及“2.3”項下各單藥揮發油乙酸乙酯溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，得到混合對照品溶液的GC 色譜圖及新加香薷飲各峰歸屬圖，見圖3及圖4。通過各圖譜對比研究，對指紋圖譜中29 個共有峰進行歸屬分析，其中3、4、5、6、12 號峰來自于連翹，7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19 號歸屬于香薷，20、21、25、26、27 號來自于扁豆花，22、23、24、28、29 號來自于厚樸，共有峰中未發現來自于金銀花的特有峰成分。通過比對指認出4 個色譜峰，其中5 號為α-蒎烯、6 號為β-蒎烯、13 號為麝香草酚、14 號為香荊芥酚。

圖3 混合對照品色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed reference substance

圖4 新加香薷飲各峰歸屬Fig 4 Assignment of the peaks of Xinjia Xiangru decoction

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件的選擇

通過查閱《中國藥典》2020年版及多篇文獻[8-12]，本研究以色譜圖中總峰面積、峰形、分離度等為參考指標，分別對供試品溶液提取中提取方式、萃取溶劑、提取時間進行了考察與優化，提取方式上分別考察了水蒸氣蒸餾法、超聲法、揮發油提取法，結果表明揮發油提取法所提取的供試品總峰面積大，峰數目多，提取效率高；提取時間上先后考察了2、4、6、8 h，發現提取4 h 較提取2 h 效果更好，但與6 h、8 h 相比差異較小，為提高效率及節約資源，故選擇提取4 h；萃取溶劑考察了乙酸乙酯、乙醚、石油醚（60～90 ℃）、正丁醇等不同溶劑，結果發現相較于其他溶劑，乙酸乙酯能完全溶解新加香薷飲中揮發性成分，對樣品無干擾，且沸點高，毒性低，更不容易揮發，制得供試品溶液更易于保存，故采用乙酸乙酯作為其萃取溶劑。

3.2 指紋圖譜色譜條件的考察

本研究考察了HP-1（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）、DB-1（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.25 mm，0.25 μm）等多種色譜柱，最終發現HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）可以滿足出峰要求，各色譜峰分離度較好，拖尾因子介于0.95～1.05，因此選用此規格毛細管柱建立新加香薷飲GC 指紋圖譜。

3.3 GC 指紋圖譜建立的意義

本研究建立了新加香薷飲的GC 指紋圖譜，并對16 批樣品進行了相似度評價，結果顯示16批樣品成分含量存在一定差異，所建立的GC 指紋圖譜測定方法可為新加香薷飲中揮發性成分的整體評價提供依據。

本研究所指認出的麝香草酚、香荊芥酚、α-蒎烯、β-蒎烯均有一定的抗菌及抗病毒[13-14]功效，以上成分可能是新加香薷飲治療流感疾病的藥效物質基礎[15]，但配伍后其相互作用機制需進一步研究。通過對16 批樣品共有峰分析發現不同產地來源所組成的新加香薷飲揮發性成分存在一定差異，不同產地對其含量及療效的影響有待進一步探索。