高效液相色譜法測定口服液體制劑中12種添加劑的含量

辜慧，李道霞，何成軍，杜鋼（四川省食品檢驗研究院，成都 611731）

口服液體制劑易被微生物污染而發霉變質，為保障該類制劑臨床用藥安全，需添加適量的防腐劑，抑制微生物的生長繁殖，達到有效的防腐目的。另外，還需添加適量甜味劑及色素，改善制劑口感及外觀，提高患者依從性[1]。然而，添加劑的超范圍使用、過量添加會對人體造成一定的傷害。人工合成色素、甜味劑和防腐劑在市場上已有濫用的趨勢，給藥品安全帶來了隱患，對消費者的健康造成了直接的威脅。目前，國內口服液體制劑生產企業眾多，所加添加劑的種類與濃度亦各不相同，關于添加劑的測定方法文獻均有報道[2-7]，未見有同時測定人工合成色素、甜味劑和防腐劑的方法報道。為了提高檢驗效率，節約成本，更全面地控制口服液體制劑的安全性，本研究建立了一種同時測定口服液體制劑中12種添加劑的高效液相色譜（HPLC）法。

1 儀器與試藥

LC-20AT 型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（日本SHIMADZU 公司）；ME204 分析天平（十萬分之一，瑞士METTLER TOLEDO 公司）；FB15065 超聲波發生器（美國Fisher 公司）；Milli-Q 型高純水發生器（美國Millipore 公司）；苯甲酸（批號：B0001649，濃度：1000 μg·mL－1）、山梨酸（批號：B0002741，濃度：1000 μg·mL－1）、酸性紅（批號：C0005676，純度：90.7%）、脫氫乙酸（批號：B0003452，純度：99.9%）、糖精鈉（批號：B0001955，濃度：1000 μg·mL－1）（BePure）；檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、誘惑紅及亮藍（A CHEMTEK INC，批號：S027451，濃度：1000 μg·mL－1）；甲醇、乙酸銨（色譜純，美國Fisher 公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：35℃；檢測波長：230 nm；進樣體積：10 μL；流動相A 為20 mmol·L－1乙酸銨溶液，流動相B 為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取酸性紅、脫氫乙酸對照品約10 mg，分別置10 mL 量瓶中，用水超聲溶解并定容至刻度，搖勻，分別作為酸性紅對照品儲備液、脫氫乙酸對照品儲備液。其余組份對照品儲備液均從對照品公司購得。再分別精密量取各對照品儲備液1 mL，置同一50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 以布洛芬混懸液為例，精密量取樣品1 mL，置10 mL 量瓶中，加水適量，超聲處理10 min，再加水定容至刻度，搖勻，經0.45 μm 濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 取陰性樣品（蛋白酶合劑）按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別量取“2.2”項下的空白溶劑（水）、混合對照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，見圖1。結果色譜圖基線穩定，峰形對稱，分離度較好，各峰保留時間適中，能夠滿足檢測需要，說明本試驗的專屬性良好。

圖1 典型HPLC 色譜圖Fig 1 Typical chromatogram by HPLC

2.3.2 線性關系考察 分別精密量取不同體積的各對照品儲備液，加水稀釋成質量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 μg·mL－1的混合對照品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，以各組分的峰面積Y為縱坐標，進樣質量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

2.3.3 檢測限及定量限考察 取混合對照品溶液，逐級稀釋成系列質量濃度，分別進樣10 μL，當峰高為基線噪音的3 和10 倍量時，測得各添加劑的檢測限及定量限，結果見表2。

表2 12 種添加劑的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限與定量限Tab 2 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOD and LOQ for 12 additives

2.3.4 精密度考察 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件下連續進樣6 次，苯甲酸等12 種添加劑峰面積的RSD為0.11%～0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性考察 取一批樣品（檢出檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅），按“2.2.2”項下方法前處理，平行制備6 份，按“2.1”項下色譜條件檢測，計算得樣品中檸檬黃平均含量為0.52 μg·mL－1，莧菜紅平均含量為3.11 μg·mL－1，胭脂紅平均含量為5.88 μg·mL－1，RSD分別為1.8%、1.4%、0.99%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.6 回收試驗 以未檢出添加劑的陰性樣品為基質，按低、中、高濃度分別精密加入混合對照品溶液（質量濃度為20 μg·mL－1）0.5、1.0、5.0 mL，按“2.2.2”項下方法處理，制備約相當于1、2、5 μg·mL－1的回收試驗溶液，每個濃度平行制備6 份。按“2.1”項下色譜條件下進行檢測，并計算回收率及RSD，結果見表3。

表3 12 種添加劑的平均回收率(n＝6)Tab 3 Average recovery of 12 additives (n＝6)

2.3.7 穩定性試驗 取回收試驗中的低、中、高濃度的溶液，室溫放置，分別于0、6、12、24、48 h 進樣，各組分峰面積的RSD均小于2.0%，表明12 種添加劑在48 h 內均穩定。

2.3.8 樣品測定 取10 批抽檢的口服液體制劑，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表4。

表4 口服液體制劑中檢測出的各成分含量測定結果(μg·mL－1，n＝3)Tab 4 Content determination of various constituent in oral liquid preparations (μg·mL－1，n＝3)

3 討論

3.1 流動相的選擇

液相色譜方法測定目標化合物時，多在流動相中加入緩沖鹽，試驗通過優化流動相梯度洗脫程序獲得合適的保留時間、峰形以及分離效果。本試驗參考文獻[8-10]，流動相選擇乙酸銨溶液-甲醇系統，考察了流動相中乙酸銨的質量濃度分別為10、20、50 mmol·L－1時對12 種添加劑色譜行為的影響。結果表明乙酸銨質量濃度為20 mmol·L－1時，12 種添加劑的色譜峰峰形尖銳，分離度較好。故最終選擇流動相為20 mmol·L－1乙酸銨溶液-甲醇體系，該流動相體系也可在檢出添加劑后，直接用于LC-MS/MS 作進一步分析確認。

3.2 檢測波長的確認

利用二極管陣列檢測器對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍分別進行波長掃描。其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸最大吸收波長均在紫外光區，檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍雖然最大吸收波長均在可見光區，但紫外光區也有較強吸收。綜合分析12 個標準物質的吸收曲線，各組分在 220～240 nm 均有較強吸收，故選擇230 nm 作為檢測波長，在此波長下基線平穩、噪聲小，各組分均具有較高靈敏度。

3.3 色譜柱的選擇

本文參考文獻[10-12]，考察了色譜柱Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）對目標化合物分離度及峰形的影響，最終選擇 Waters XBridge C18色譜柱，結果12 個目標化合物可以達到分離測定的要求，且準確可靠、重復性好。

3.4 其他

本試驗采用HPLC 法同時測定口服液體制劑中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍的含量，該方法操作簡便、精密度好、回收率高，能滿足檢測要求，適用于口服液體制劑中人工合成色素、甜味劑和防腐劑的檢查。結果發現目前國內一些藥品中仍存在著添加劑濫用的現象，存在較大的安全隱患，需要進行嚴格監管。