青蒿琥酯脂質體的處方優化及抗非小細胞肺癌評價

吳小瑜，龍苗苗，毛靜，程沁園，邱立朋*，陳敬華（.江南大學藥學院，江蘇 無錫 4；.無錫衛生高等職業技術學校藥學系，江蘇 無錫 408）

癌癥作為世界三大疾病之一，其新發病例與死亡人數正逐年遞增。與其他國家相比，我國癌癥治療現狀不容樂觀，發病率和致死率均居于第一位[1]。多年來，癌癥的治療受到廣泛關注，化療作為其治療的重要策略，不良反應嚴重、缺乏選擇性、患者耐受性差等缺點影響了其臨床治療效果[2-3]。納米給藥系統的迅速發展為癌癥的臨床治療開辟了新的方向，通過給藥系統的包載可以有效降低藥物的毒副作用，增加藥物的穩定性，降低給藥劑量。此外，納米給藥系統的應用還可以增加藥物的體內循環時間，實現緩釋給藥等作用。

青蒿琥酯（artesunate，ART）是青蒿素衍生物，一直是抗腫瘤藥物研究的熱點，對很多腫瘤具有較好的抑制作用[4-5]。Efferth 等[6]發現青蒿琥酯對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和中樞神經系統腫瘤等都有較好的抑制作用。然而，ART 的溶解度較低，遇水容易降解，半衰期短，對腫瘤選擇性較差，生物利用度低，無法發揮較好的抗腫瘤效果[7]，限制了臨床應用。因此，將其制備成新型納米制劑是一個理想的選擇。脂質體是納米制劑的一種，一般是由磷脂和膽固醇構成的一種雙分子層小囊泡，具有類似生物膜結構的特性，這種特殊的結構能夠有效改善藥物水溶效果，維持藥物活性，提高藥物的生物利用度[8-12]。磷脂和膽固醇是構成細胞膜的關鍵成分，因此脂質體表現出良好的生物相容性，通過與靶標細胞的吸附與融合能實現藥物的有效輸送。

雖然青蒿琥酯脂質體（ART-liposome）的文獻已有報道，但大多側重作用機制、功能修飾及對肝癌的治療等，缺乏對ART-liposome 制備處方工藝及抗非小細胞肺癌的研究。因此，本文在前期篩選的基礎上，對關鍵的制備處方和工藝進行優化，制備出粒徑均勻的ART-liposome，并對其體外抗非小細胞肺癌作用進行評價。

1 材料

1.1 儀器

Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀（英國Malvern儀器有限公司）；JEM-2100 透射電鏡（日本日立公司）；UV-2550 紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）；Multiskan GO 酶標儀（美國Thermo Fisher Science 公司）；Ti2-E＋A1 激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 試藥與細胞

氫化大豆磷脂（HSPC，德國Lipoid GmbH）；膽固醇（阿拉丁試劑有限公司）；青蒿琥酯（上海麥克林生化科技有限公司）；多聚甲醛、氯仿、二甲亞砜（DMSO）（國藥集團上海試劑公司），DMEM 細胞培養基（美國Thermo Fisher Science公司）；噻唑藍（MTT）、青霉素-鏈霉素（上海生工生物工程有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、DAPI 染色液（碧云天生物技術有限公司）；Calcein-AM/PI 細胞雙染試劑盒（Abcam 試劑有限公司）；人非小細胞肺癌細胞A549（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 脂質體處方篩選及制備

采用薄膜分散法制備脂質體并對HSPC 和膽固醇的比例（摩爾比分別為2.0∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.5）進行篩選。以1.0∶1.0 為例，稱取等摩爾比的HSPC 和膽固醇溶于適量氯仿，將溶液轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去氯仿，至圓底燒瓶上形成一層均勻的薄膜，將圓底燒瓶置于真空干燥箱24 h，進一步除去氯仿。干燥結束后在圓底燒瓶中加入10 mL 去離子水，超聲破碎得到脂質體。隨后用動態光散射法（DLS）測定脂質體的粒徑、多分散系數（PDI）及電位。

2.2 納米化時間篩選

選擇超聲破碎法對所制得的脂質體進行處理，為得到尺寸更小、粒徑均一的脂質體，筆者對超聲時間進行了篩選。用超聲破碎儀對按“2.1”項下方法制得的脂質體分別進行3、5、10、15 min的超聲破碎，隨后采用DLS 測定脂質體的粒徑及電位。

2.3 載藥脂質體的制備及表征

將篩選出的最優比例的HSPC 和膽固醇溶于氯仿，并加入適量ART 后，將溶液轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去氯仿，至圓底燒瓶上形成一層均勻的薄膜，將圓底燒瓶置于真空干燥箱24 h，進一步除去氯仿。干燥結束后在圓底燒瓶中加入10 mL 去離子水超聲破碎得到載藥脂質體，并用透析法除去未載入的ART，制備得到ARTliposome。用納米粒度儀測定脂質體的粒徑及電位，用透射電鏡（TEM）觀察其形貌。

2.4 藥物釋放

通過動態透析法研究載藥脂質體的體外藥物釋放行為。向透析袋中加入載藥脂質體，分別浸泡在20 mL pH 7.4 和5.0 的PBS 中，并置于37 ℃搖床中，搖床轉速為100 r·min－1，在特定的時間點取出1 mL PBS 用于測量ART，并補充相同體積新的PBS。利用紫外分光光度法測定ART 的釋放量（Er）。計算公式如下：

取樣體積和釋放介質的總體積分別以Ve和V0表示，膠束中藥物含量以m表示；第i次取樣時樣品濃度以Ci表示。

2.5 脂質體細胞毒性

采用MTT 法考察脂質體的體外毒性，并選擇A549 細胞作為體外細胞模型。將細胞以6000個/孔的密度鋪于96 孔板中，然后于37 ℃培養箱中培養12 h 使其貼壁生長，棄去原培養基并補加100 μL 含不同質量濃度空白脂質體或載藥脂質體的培養基，繼續孵育48 h 后每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg·mL－1），孵育4 h。隨后棄去MTT 溶液，加入相同體積的DMSO 溶解藍紫色晶體，在570 nm 波長下測定吸光度值并計算細胞存活率，以未經脂質體處理的細胞作為對照。細胞存活率（%）＝脂質體組吸光度/空白組吸光度×100%。

2.6 細胞狀態觀察

將細胞以3×104個/孔的密度鋪于24 孔板中，然后于37℃培養箱中培養12 h 使其貼壁生長，棄去原培養基并補加1 mL 含不同質量濃度的游離藥物和載藥脂質體的培養基，繼續孵育48 h 后用顯微鏡觀察細胞形態。

2.7 細胞攝取

將細胞以2×105個/孔的密度鋪于6 孔板中，然后于37℃培養箱中培養12 h 使其貼壁生長，棄去原培養基并補加2 mL 含不同質量濃度載藥脂質體的培養基，繼續孵育48 h。棄去培養基并用預冷的PBS 洗滌3 次，每孔加入500 μL 細胞裂解液裂解細胞并離心收集（12 000 r·min－1，10 min），測定上清液中青蒿琥酯的含量。

2.8 Calcein-AM/PI 細胞染色

將細胞以1×105個/孔的密度鋪于激光共聚焦小皿中，然后于37 ℃培養箱中培養12 h 使其貼壁生長，棄去原培養基并補加2 mL 不同質量濃度的載藥脂質體的培養基，繼續孵育48 h 后用Calcein AM/PI 染色15 min，然后用預冷的PBS洗滌3 次，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.9 統計分析

所有統計分析均采用SPSS 17.0 軟件完成，數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示，組間差異通過獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HSPC 與膽固醇比例篩選

如圖1所示，4 種脂質體粒徑都在納米級，且都帶有負電性，HSPC 與膽固醇比例為2.0∶1.0 與1.0∶2.5時，制得的脂質體粒徑較大且分布不均勻，PDI 也較大；比例為1.0∶1.0 與1.0∶1.5，粒徑較小且分布較為均勻，其中1.0∶1.0 制備的脂質體負電荷更強，更有利于其血清穩定性，因此選擇HSPC 與膽固醇比例為1.0∶1.0 進行脂質體制備。

圖1 HSPC 與膽固醇不同摩爾比脂質體的粒徑（A）、電位（B）以及PDI（C）Fig 1 Effect of different molar ratios of HSPC and cholesterol on the liposome particle size（A），zeta potential（B）and PDI（C）

3.2 超聲時間篩選

通過DLS 測定不同超聲時間處理的脂質體的粒徑和PDI，結果如圖2所示。隨著超聲時間的延長，脂質體的粒徑逐漸減小，超聲破碎10 min時脂質體的粒徑在110～120 nm 且分布均勻（PDI約為0.25），經腫瘤增強滲透滯留效應（EPR）可以有效地蓄積在靶標部位。但是在超聲15 min 時粒徑分布圖顯示出現雙峰，PDI 也逐漸增大，推測是過度超聲破壞了脂質體的結構，部分脂質體發生絮凝，因此超聲時間選擇10 min。

圖2 不同超聲時間制備的脂質體的粒徑（A）、PDI（B）以及粒徑分布圖（C）Fig 2 Effect of different ultrasonic times on the liposomes particle size（A），PDI（B）and particle size distribution（C）

3.3 載藥脂質體的表征

如圖3所示，ART-liposome 粒徑為（120±5.01）nm，TEM 結果顯示ART-liposome 呈規則的球形，且大小均勻。這一特點可使脂質體不被網狀內皮系統吞噬，并經EPR 效應蓄積到靶標部位[13]。ARTliposome 的包封率為（92.45±3.57）%，載藥量為（15.72±1.31）%，表明脂質體對ART 具有良好的包載藥物的能力。

圖3 載藥脂質體的TEM 圖（A）和粒徑圖（B）Fig 3 TEM image（A）and particle size distribution（B）of ARTliposome

3.4 體外藥物釋放

如圖4所示，載藥脂質體在pH 7.4 的PBS 中累積釋放率在30%左右，說明脂質體在血液中維持良好的穩定性，可以有效減少血液輸送過程中的藥物泄露，降低對正常組織的毒副作用。然而，ART-liposome 在pH 5.0 的PBS 中累積釋放率達到了60%。這可能是由于青蒿琥酯在弱酸性環境中的溶解度比中性條件下高，擴大藥物在脂質體和溶出介質中的濃度差，更有利于藥物的溶出。以上結果表明載藥脂質體在腫瘤部位酸性條件下可以釋放出藥物，增加腫瘤部位藥物蓄積量，提高治療效果。

圖4 不同pH 條件下載藥脂質體的藥物釋放情況Fig 4 Drug release of ART-liposome at different pH condition

3.5 體外細胞毒性

如圖5A 所示，即使空白脂質體的濃度達到500 μg·mL－1，細胞存活率仍高于85%，說明空白脂質體對細胞基本無毒。以游離ART 作為對照組，通過MTT 法考察了載藥脂質體在48 h 的體外細胞毒性。結果顯示，隨著ART 濃度的增加細胞存活率下降，且游離ARTIC50值在24 h 和48 h 分別為（58.79±5.1）μg·mL－1和（81.94±8.4）μg·mL－1，游離藥物細胞毒性藥強于ART-liposome（見圖5B）（P＜0.05）。

圖5 空白脂質體（A）和ART-liposome（B）在48 h 的細胞毒性（P＜0.05）Fig 5 Cytotoxicity of blank liposomes（A）and ART-liposome（B）at 48 h（P＜0.05）

3.6 細胞形態

如圖6所示，未加藥物的空白培養基中細胞成明顯的梭形，排列緊密且貼壁生長，細胞狀態良好。而經ART-liposome 孵育的細胞數目明顯減少，且與濃度成負相關，大量細胞變圓且邊緣發亮，證明細胞貼壁不牢，生長狀態差或已經死亡，說明ART-liposome 對腫瘤細胞有殺傷作用。

圖6 經不同質量濃度ART 和ART-liposome 處理后細胞狀態Fig 6 A549 cells treated with different concentrations of free ART and ART-liposome

3.7 細胞攝取

如圖7所示，游離ART 的攝取量高于ARTliposome（P＜0.05），這可能是由于小分子藥物ART 依靠被動擴散進入細胞，而脂質體則可能通過胞飲等主動轉運方式進入細胞，具有能量依賴性。此外，隨著孵育時間的延長，細胞對ARTliposome 的攝取明顯增加，表現出明顯的時間依賴性。

圖7 A549 細胞對ART-liposome 的攝取情況（*P＜0.05）Fig 7 Uptake of ART-liposome by A549 cells（*P＜0.05）

3.8 Calcein-AM/PI 細胞染色

如圖8所示，對照組細胞被染成明顯的亮綠色，細胞呈梭形，生長狀態良好。ART-liposome組有大量細胞核被染成紅色，且濃度越高死亡數目越多。被染成綠色的活細胞形狀不再是梭形，而是呈圓形或橢圓形，表明細胞狀態不佳。3D模式下熒光圖更為直觀地表明了這一特點（見圖8B），這說明ART-liposome 能夠有效地殺死腫瘤細胞。

圖8 經不同質量濃度制劑處理的A549 細胞熒光平面圖（A）和立體圖（B）Fig 8 Plane fluorescence images（A）and stereo fluorescence images（B）of A549 cells treated with different concentrations of free ART and ART-liposome

4 討論

青蒿素及其衍生物對乳腺癌、白血病、前列腺癌等多種腫瘤有抑制其生長的活性，是潛在的高效低毒的新一類抗腫瘤藥物。其中，ART 不但對多種腫瘤細胞有抑制作用，還可以增加腫瘤細胞的放射敏感性和逆轉腫瘤細胞對傳統藥物的多耐藥性。此外，它有選擇性高、安全性好及劑量低等優勢，符合當前抗腫瘤藥物開發思路。然而，由于ART 半衰期短、溶解度低、遇水易降解，難以制成液體制劑，限制了其作為抗腫瘤藥物在臨床的應用。

脂質體是較為成熟的納米制劑，具有生物相容性和腫瘤靶向性等優點，目前已有多種脂質體抗腫瘤藥物上市。雖然已有文獻制備ARTliposome，驗證了其抗腫瘤作用，但缺乏詳細的脂質體制備方法和工藝，或僅為通過醋酸鈣梯度法等制備功能化ART-liposome[14-15]，對具有工業化潛力的ART-liposome 處方和工藝研究較少。此外，已有文獻報道ART 可以降低非小細胞肺癌的發生與侵襲[16]，增加其放療的敏感性[17]，但ARTliposome 對非小細胞肺癌的治療作用尚無報道。

因此，本文在前期實驗篩選基礎上，選擇HSPC 和膽固醇為主要處方材料，通過薄膜分散法優化兩者配比，并篩選超聲工藝，制備ARTliposome。最終ART-liposome 粒徑較小，外形均一，具有較高的載藥量。通過細胞毒性、生長狀態、攝取情況以及染色觀察，驗證ART-liposome的體外抗腫瘤活性。雖然結果顯示游離藥物通過被動擴散能夠更快地進入腫瘤細胞發揮作用，但是，游離藥物水溶性差，并缺乏腫瘤選擇性，可能引起全身不良反應。ART-liposome 通過EPR效應被動靶向到腫瘤組織，然后被非小細胞肺癌A549 細胞攝取，發揮抗腫瘤作用。目前本研究僅通過體外抗腫瘤評價了ART-liposome 作為抗腫瘤新劑型的可行性，動物體內抗腫瘤作用、體內安全性等還需要進一步驗證。此外，還可以對脂質體進行深入修飾，引入長循環、主動靶向等特性，制備多功能化ART-liposome。