蒙藥益母草對心血管系統和中樞神經系統的影響

張微，李君，胡玉霞，張謙，郭佳慶，張丁元，程明杰，常福厚*（1.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010110；2.內蒙古自治區新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110；.內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，呼和浩特 010110）

蒙藥益母草（Leonurus japonicusHoutt.）為唇形科（Lamiaceae）益母草屬（Leonurus）植物益母草的新鮮或干燥地上部分，被收載于《神農本草經》和 《本草綱目》，其具有活血化瘀、利尿消腫之功效[1]，別名益母艾、苦草、坤草等，其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝經，具有活血化瘀、利尿消腫之功效。益母草主要含有生物堿類、黃酮類和二萜類成分，被蒙醫視為瘡疾圣藥，是蒙藥處方使用的道地藥材。益母草目前在我國臨床上應用越來越廣泛，主要用于月經不調、產后瘀痛、心腦血管疾病、血液病等疾病的治療，但現代藥理毒理研究甚少，其質量標準體系和安全性評價有待深入研究。

目前尚未有研究數據來綜合評價益母草對于心血管系統和中樞神經系統的毒性。本項目采用植入式生理信號遙測系統（DSI）觀察清醒比格犬灌胃益母草細粉混懸液后對于心血管系統的影響；通過大鼠運動協調試驗、小鼠自主活動試驗和戊巴比妥鈉閾下催眠試驗，考察益母草對中樞神經系統的影響[2-6]。一方面，為蒙藥益母草的藥用安全性提供科學依據；另一方面，為內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心將要建立的蒙藥毒理數據庫提供資料。

1 材料

1.1 試藥

益母草（安國路路通中藥飲片有限公司，批號：20180117，經內蒙古醫科大學生藥學教授渠弼鑒定為正品）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（天津市光復精細化工研究所，批號：20170810）；布洛芬緩釋膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號：20171208，規格：0.3 g/粒）；碘伏（文水大有實業有限公司，批號：20170315）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號：D16070503）。

1.2 儀器

植入式生理信號遙測系統（美國Data Sciences International 公司）；動物麻醉機（美國Matrx公司）；YLS-1C 小動物活動記錄儀、YLS-31A 大小鼠轉棒測試儀、YLS-27A 大小鼠尾部自動標號儀（濟南益延科技發展有限公司）；DS-Y350 型粉碎機（上海市頂帥工貿有限公司）；CIC1P1-150FE-L 電子秤、BSA4202S 分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；灌注器（蘇州偉康醫療器械有限公司，批號：170305）；胃管（太平洋醫材股份有限公司，批號：15025519）。

1.3 實驗動物

普通級Beagle 犬6 只，5～6月齡，雌雄各半[北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0001]，動物初次給藥體質量：10.45～13.85 kg，飼養于內蒙古醫科大學藥物安全性評價中心普通設施，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003，環境控制（溫度：18～26℃，日溫差＜3℃，濕度：40%～70%，12 h/12 h 明暗交替）。單籠飼養，每籠1 只，飼料為購于北京科奧協力飼料有限公司的犬維持飼料，定時定量投飼（在動物實驗前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

SPF 級ICR 小鼠80 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質量：18～22 g；SPF 級SD 大鼠40 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質量：170～250 g [北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001]。大、小鼠飼養于內蒙古醫科大學藥物安全性評價中心屏障設施，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003。環境控制（溫度：20～26℃，日溫差＜3℃，相對濕度：41%～64%，換氣次數≥15 次·h－1，12 h/12 h 明暗交替），飼養密度：5 只/籠，飼料為購于北京科奧協力飼料有限公司的60Co 放射滅菌鼠全價顆粒飼料，定時定量投飼（在動物實驗前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

2 方法

2.1 手術及護理

在Data Sciences International 公司工程師指導下，參照DSI D70-PCTR 手術指南方法進行植入手術，術前用異氟烷麻醉實驗動物，術中維持，麻醉后對實驗動物進行充分備皮，主要包括整個胸腹部和腹外側及前肢內側，備皮面積要大于手術區域；植入過程主要包括植入子主體植入、壓力導管的植入及電極的植入。植入子主體放于實驗動物腹部左側；心電電極采用模擬標準Ⅱ導聯放置，實驗動物胸右側2～3 肋間隙與鎖骨中線相交處為電極負極，胸左側12～13 肋骨體與腋中線相交處為電極正極；呼吸電極植入結束后應對基線阻抗進行確認，確保呼吸波幅在（60±10）ohms 范圍內；壓力導管插入腹股溝腹動脈，為防止壓力導管因犬活動拉扯滑出，壓力導管植入后應預留O 型回路并用非吸收線縫合固定。手術植入及縫合結束后進入護理周期，術后給予布洛芬緩釋膠囊3 d，1 次·d－1，1 粒/次，每日使用碘伏對傷口消毒1 次，連續7 d，恢復期3～4 周，待全部動物恢復后開始給藥。

2.2 分組及給藥

2.2.1 比格犬分組及給藥 6 只比格犬采用拉丁方進行實驗組別設計，分為4 組，即溶媒對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（0.24、0.72、2.16 g·kg－1）（約相當于人臨床擬用劑量倍數的2、6、18 倍，人體質量按70 kg 計算，益母草人臨床擬用量為9 g，即0.12 g·kg－1），設4 個給藥周期，各給藥周期間隔7 d。實驗組別設計詳見表1。

表1 益母草細粉混懸液心血管系統安全性藥理組別設計Tab 1 Design of cardioprotective pharmacology group for leonuri herba suspension

2.2.2 小鼠及大鼠分組及給藥 根據體質量、性別隨機分組，實驗給藥劑量詳見表2。

表2 中樞神經系統安全性藥理劑量設計Tab 2 Design of central nervous system of leonuri herba suspension

2.3 數據采集

2.3.1 比格犬心電、血壓、體溫試驗 采用植入式生理信號遙測系統采集動物心電、血壓及體溫指標，心電指標包括心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、R 波、ST 段、T 波。記錄給藥前1～2 h 基礎數據及給藥后24 h 數據。采集間隔為每10 s 系統自動記錄一次。統計時選取給藥前0.5 h（給藥前基礎值）及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、14、18、24 h，取每個時間點后5 min平均值作為該時間點數據，剔除因動物躁動等因素引起的大幅度漂移數據。

2.3.2 小鼠自主活動影響試驗 選用5～6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機分為4組，即溶酶對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（1.2、2.4、4.8 g·kg－1），每組10 只，各組別分別經口單次灌胃。于給藥前30 min 及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 時間點放入記錄儀的活動箱中，測定各組小鼠活動情況，記錄10 min 內的自主活動次數。

2.3.3 小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠影響試驗 選用5～6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機分為4 組，即溶酶對照組（1% CMCNa），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（1.2、2.4、4.8 g·kg－1），每組10 只。于給藥后6 h 腹腔注射30 mg·kg－1戊巴比妥鈉，注射體積均為10 mL·kg－1（質量濃度為3.0 mg·mL－1），即刻開始觀察注射戊巴比妥鈉30 min 內每組翻正反射消失達1 min 以上的動物數，凡30 min 內動物翻正反射消失達1 min 以上者，表明發生了睡眠，翻正反射恢復即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間。記錄每組發生睡眠的小鼠數和入睡潛伏期、睡眠時間。

2.3.4 大鼠協調運動的影響試驗 SD 大鼠置于大小鼠轉棒儀滾筒上訓練，轉速為12 r·min—1。訓練結束后，選取能在轉棒儀滾筒上維持3 min 以上不掉落的大鼠40 只，雌雄各半，按潛伏期分為4 組，即溶酶對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（0.81、1.62、3.24 g·kg－1），每組10 只。分別經口灌胃給藥。分別于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 將大鼠放在轉棒儀滾筒上，記錄每只大鼠從轉棒儀滾筒上掉落所用時間，若10 min 以上不掉落則以10 min 計。

2.4 數據處理與分析

計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理分析。用Levene’s test 方法檢驗方差齊性，若方差齊用單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，兩組間用LSD test（參數法）進行比較分析。若方差不齊，用Kruskal-Wallis 檢驗，兩組間用Dunnett’s Test（非參數方法）進行比較分析。

3 結果

3.1 益母草細粉混懸液對清醒比格犬心血管系統的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，蒙藥益母草細粉混懸液高、中、低劑量組清醒比格犬的心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P波、T 波、ST 段及R 波均未出現明顯改變（P＞0.05），結果如圖1所示。

圖1 益母草細粉混懸液對清醒比格犬各項指標的影響Fig 1 Effect of leonuri herba suspension on indicators of conscious Beagle dogs

3.2 益母草細粉混懸液對清醒比格犬血壓的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組對清醒Beagle 犬的收縮壓、舒張壓及平均壓均未產生明顯影響（P＞0.05），結果如圖2所示。

圖2 益母草細粉混懸液對清醒比格犬收縮壓（A）、舒張壓（B）和平均壓（C）的影響Fig 2 Effect of leonuri herba suspension on systolic blood pressure（A），diastolic pressure（B），and average pressure（C）of conscious Beagle dogs

3.3 益母草細粉混懸液對清醒比格犬體溫的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組體溫未出現明顯改變（P＞0.05），結果如圖3所示。

圖3 益母草細粉混懸液對清醒比格犬體溫的影響Fig 3 Effect of leonuri herba suspension on temperature of conscious Beagle dogs

3.4 益母草細粉混懸液對小鼠自主活動的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組自主活動次數未出現明顯改變（P＞0.05），結果如圖4所示。

圖4 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠自主活動的影響Fig 4 Effect of leonuri herba suspension on spontaneous activity of ICR mice

3.5 益母草細粉混懸液對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組睡眠潛伏期及睡眠時間均未出現明顯改變（P＞0.05），結果如圖5所示。

圖5 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的影響Fig 5 Effect of leonuri herba suspension on sleep latency and sleep time of ICR mice

3.6 蒙藥益母草細粉混懸液對大鼠協調運動的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組大鼠協調運動未出現明顯改變（P＞0.05），結果如圖6所示。

圖6 益母草細粉混懸液對SD 大鼠協調運動的影響Fig 6 Effect of leonuri herba suspension on coordinated exercise of SD rats

4 結論與討論

安全藥理學是考察受試藥物在治療范圍以內或治療范圍以上劑量時，潛在的不期望出現的對生理功能的不良影響，即觀察藥物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的影響[7-11]；目前諸多關于心血管系統安全藥理學的研究多采用麻醉或束縛狀態下的實驗動物，麻醉或束縛狀態下所采集的心電、血壓及體溫等參數可能會對實驗產生較大的影響，在研究特殊藥物時，可能還會與受試藥物產生相互作用；ICH-S7A《人用藥物安全藥理學研究指導原則》建議采用清醒動物遙測技術進行心血管系統實驗，最大限度降低因麻醉劑、人為操作、動物應激等因素對實驗產生的干擾[12-14]。結果表明，益母草細粉混懸液在0.24～2.16 g·kg－1劑量范圍內對清醒比格犬的心電、血壓及體溫無明顯影響；在1.2～4.8 g·kg－1劑量范圍內對ICR 小鼠自主活動、睡眠潛伏期及睡眠時間無明顯影響；在0.81～3.24 g·kg－1劑量范圍內對SD 大鼠協調運動無明顯影響。