溫腎健脾方對脾腎陽虛證腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型腸組織蛋白組學的影響

張喆,李依潔,魏瑋,劉瑜,符思,蘇曉蘭

1.中日友好醫院中醫脾胃病科，北京 100029；2.中國中醫科學院望京醫院脾胃病科

腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)是一組持續或間歇發作，以腹痛、腹脹、排便習慣和(或)大便性狀改變為臨床表現，而缺乏胃腸道結構和生化異常的腸道功能紊亂性疾病[1]，通過前期研究[2]發現針對IBS-D脾腎陽虛證制定的溫腎健脾方中高劑量組通過調節免疫、抗炎、調節腸神經系統運動、改善胃腸道激素紊亂、降低內臟高敏感等方面起到了改善腹瀉的作用，本次研究擬通過蛋白組學研究挖掘脾腎陽虛證IBS-D大鼠蛋白質的表達特征及溫腎健脾方中、高劑量組可能的干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡(70 g)雄性SD大鼠50只，級別SPF/VAF，許可證號：SCXK(京)2011-0004，購自斯貝福實驗動物科技有限公司。恒溫(23～25 ℃)飼養，燈光環境和避光各12 h，大鼠自由進食標準顆粒飼料。北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0038。

1.2 主要試劑及儀器 水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140827)；甲醛(北京益利精細化學品有限公司，產品標準編號：YZB/京0099-2011)；番瀉葉(北京康美藥業有限公司，產品批號：140181491)；尿素(Bio-Rad，貨號：161-0731，美國)；蛋白定量染液(Thermo Scientific，貨號：23238，美國)；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，貨號：A2058，美國)；Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2 μg)。

U-TvO.5xC.24H01726顯微鏡(OLYMPUS公司)；RM2255切片機(Lejca公司)；H1122Q烤片機(Leica公司)；Eql50H脫水機(Lelca公司)；10K超濾管(Sartorious，PN：VN01H02)；6標TMT?試劑盒(TMTsixplex Label Reagent Set)(Thermo Scientific Pierce，PN：90066)；超聲波細胞破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司，型號：XO)；酶標儀(Thermo，型號：Multiskan MK3)；真空冷凍干燥機(Thermo，型號：SPD2010-230)；RIGOL L-3000高效液相色譜系統(北京普源精電科技有限公司)；高效液相色譜儀(Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)；質譜系統(Thermo，型號：Q-Exactive)。

1.3 藥物制備 溫腎健脾顆粒劑：肉豆蔻15 g、補骨脂30 g、五味子9 g、吳茱萸9 g、黨參30 g、白術15 g、郁金18 g、生姜10 g、大棗10 g。以上藥物均購自望京醫院，由四川新綠藥業科技發展股份有限公司制備為顆粒劑，每劑146 g，經沸水沖溶后置涼使用。

1.4 方法

1.4.1 分組與干預方法 50只SD大鼠，適應性喂養1周后，隨機選取10只為健康對照組(N組)，其余各組參考前期研究[3]，以AL-ChaerED[4]的造模方法為基礎，同時予番瀉葉灌胃聯合夾尾刺激，即采用物理化學刺激共同作用的方法制備脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型。N組全過程正常飼養，無造模及其他干預。造模大鼠進行為期4周的造模干預后，N組與造模大鼠各隨機取1只大鼠行腸道病理組織學觀察。再參考存活數量，將造模組剩余大鼠隨機分為模型組(M組)、溫腎健脾方中劑量組(ZZ組)、溫腎健脾方高劑量組(ZG組)和西藥組(W組)4組，其中ZZ組、ZG組分別給予3.10、1.55 g·kg-1·d-1的溫腎健脾方顆粒灌胃，2 mL/次，2次/d；W組予匹維溴銨(公司名稱：Abbott Products SAS，生產批號：635518)以1.61 mg·kg-1·d-1灌胃，2 mL/次，2次/d；M組予等容量蒸餾水灌胃；干預周期14 d。

1.4.2 蛋白質提取、定量 采用Bradford法測定蛋白濃度[5]。蛋白定量后將200 μg蛋白溶液放于離心管中進行蛋白酶切，脫鹽后采用Nanodrop測定各樣品中肽段的含量。分別取N組、M組、ZZ組、ZG組和W組大鼠距肛緣8 cm以上的結腸組織，每組做3只大鼠為生物重復，采用TMT sixplex Isobaric Mass Tagging Kit(Thermo Scientific)試劑進行蛋白標記，取等量所有實驗樣品混合樣作為參考組Pool樣品。將標記后的樣品混合，用RIGOLL-3000高效液相色譜系統進行肽段樣品預分，共得到15個合并組分。Nanodrop測定每個組分的肽段濃度。使用臺式四級桿-軌道阱高分辨質譜儀Q Exactive進行反相色譜串聯質譜分析，液相色譜為EASY-nLC1000。質譜原始文件由 Proteome Discoverer(版本1.4.0.288，Thermo Scientific)進行檢索，數據庫為Uniprot大鼠蛋白質數據庫(50 837 個蛋白序列，2013-06)及污染庫(215 蛋白序列)。

1.4.3 生物信息學分析 使用DAVID生物信息學資源6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)和PANTHER 在線網站，進行Gene Ontology(GO)注釋、蛋白的細胞定位和生物學過程等分析，根據P值選取富集顯著性排序前十位的注釋項。蛋白功能通路利用 KEGG數據庫獲得。

2 結果

2.1 基本鑒定信息 3次重復試驗的數據合并后發現，最終鑒定確定了7 934個蛋白，總肽段數為69 261個，獨有的肽段序列數59 350，匹配的圖譜數為267 247。

2.2 數據篩選 在每個3次重復試驗中，至少2次檢測到，同時入選的蛋白需要至少2個獨有的肽段序列數；為了提高數目的使用率，對于只有1個獨有的肽段序列數的蛋白質，如果該肽段在所有的樣品中都能檢測到，那么我們也將對該蛋白進行定量分析；經篩選后，列表蛋白縮減為6 523個。然后在感興趣的組之間做Studentt檢驗，P<0.05的蛋白認為是差異表達的蛋白，在差異蛋白列表以“+”標出，同時計算出該蛋白ratio的均值和標準差，這樣共鑒定到405個差異蛋白。

405個差異蛋白中，以ratio倍數改變>1.2或<0.8，在M組與N組相比的差異蛋白中篩選明顯上調或下調的蛋白，共有163個，包括81個上調蛋白和82個下調蛋白；進一步挖掘這163個差異蛋白，確定經治療后ratio在1.2到0.8之間的蛋白存在回歸趨勢，篩選后發現ZZ組、ZG組、W組分別有79、18、117個蛋白有回歸趨勢，即經治療后蛋白水平與N組相當，包括上調蛋白71個、下調蛋白67個。

2.3 差異蛋白的功能分析 利用 PANTHER 在線軟件(http：//www.pantherdb.org/)，針對405個差異蛋白進行功能分析，通過DAVID網站對具有差異的功能分析(P<0.05)進行進一步闡釋，包括蛋白質參與的生物學過程(biological process)、分子功能(molecular functions)和細胞定位(cellular components)。分析結果所示，差異蛋白行使的主要生物學功能有：細胞構成或合成、細胞的過程、定位、繁殖、生物調節、對刺激的反應、發展的過程、多細胞生物過程、運動、生物黏附、代謝過程、生長和免疫系統的過程，其中涉及代謝途徑、細胞過程、細胞構成和定位方面的達70%以上；示差異蛋白涉及的分子功能主要包括結合及轉錄調節因子、受體、結構分子、信號轉導、通道調節、催化和轉運等活性調節功能，其中催化活性、結合、結構分子活性為主要功能，占90%；差異蛋白在細胞定位方面主要定位于細胞連接、細胞膜、大分子復合物、細胞外基質、細胞的一部分、細胞器和胞外區，其中細胞部分、細胞器和大分子復合物占80%以上。

2.4 差異蛋白的KEGG通路分析 采用DAVID網站分析405個差異蛋白在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中的富集情況，提示了最相關的6個通路的蛋白數量(P<0.05，且比值>3%)，包括：代謝途徑(54)、核糖體(15)、氧化磷酸化(14)、阿爾茨海默病(14)、亨廷頓病(14)和剪接體(11)。

2.5 根據主要通路篩選重點差異蛋白 從6個主要信號通路涉及的差異蛋白中，篩選在M組/N組差異較大(ratio>1.2或<0.8)，并于ZZ組或ZG組治療后有回歸趨勢(ratio在1.2至0.8之間)的蛋白，總結其在各組表達的情況。發現共涉及16個差異蛋白：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1、Mrpl14、Mrpl12、Mrpl2、Gsk3b、Tgm2、Srsf6、Wbp11和Snrpd2；Naprt1、Naglu、Mrpl2在ZG組表現出回歸趨勢，除了Naglu的其余15個蛋白均在ZZ組表現出回歸趨勢：蛋白Cox6b1同時存在于代謝途徑、氧化磷酸化、阿爾茨海默病和亨廷頓病4條通路(見表1)。

表1 主要通路中表達重點差異蛋白

3 討論

本研究所選用的對照西藥為匹維溴銨，是一種鈣通道阻斷性季銨化合物[6]，可改善運動障礙、降低內臟敏感性，是針對IBS腹痛、排便紊亂等不適有公認療效的解痙藥[7]。參照匹維溴銨既往的治療機制和蛋白組學研究，分析全部405個差異蛋白后發現，ZZ組和W組共同回歸的蛋白有65個，占到ZZ組回歸蛋白的82.28%，提示了溫腎健脾方臨床劑量(ZZ組)的治療機制與匹維溴銨有高度的相似性。

通過研究結果發現從蛋白組學的角度各組差異蛋白主要影響了6條相關信號通路。在分析代謝途徑信號通路時，本次實驗在該通路主要涉及脂質代謝和多聚糖生物合成與代謝2種。進一步分析后發現，其中有8個蛋白經造模后與正常組出現較大差異并于中藥治療后差異縮小回歸正常水平：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1，以上這些蛋白與胃腸道腫瘤、膽紅素代謝、鉛中毒腎損害、脂肪酸合成、腫瘤應激、免疫調節等方面相關性較強，但目前文獻中均未發現它們與IBS發病和治療的相關性研究。氧化磷酸化通路、核糖體通路的相關蛋白與代謝途徑信號通路情況類似，相關主要蛋白在目前研究進展中未發現與IBS發病和治療的明顯相關性。

從其他差異蛋白來看可能與腦腸互動和腸道慢性炎癥的病理因素相關性較高。本組在分析阿爾茨海默病通路時發現其中的糖原合成激酶-3βGsk3b為絲/蘇氨酸磷酸激酶的B型亞基，該基因分布廣泛并與多種疾病病機有關，如阿爾茨海默病及帕金斯綜合征、腫瘤、骨骼發育和新陳代謝、肥胖和2型糖尿病等[8]。阿爾茨海默病的特征之一是微管相關蛋白tau的異常磷酸化，而GSK3b是引起其磷酸化的重要蛋白——過表達的GSK3b會降低細胞核β-catenin的表達，引起tau的過度磷酸化和大腦神經退行性改變。此外，GSK3b可通過負調控IL-17的信號級聯，從而抑制炎癥相關通路的因子[9-10]。

基于IBS有腦腸互動和腸道慢性炎癥的病理因素，結合本研究中蛋白的表達趨勢，推斷M組大鼠由于造模影響引起Gsk3b表達增高，考慮可能降低了β-catenin的表達、引起tau的過度磷酸化和腦神經的異常改變；而治療后該蛋白表達下降，表現出回歸正常趨勢，可能是通過調控β-catenin的表達，維持了Wnt/β-catenin信號通路的穩定，進一步可保障腸道黏膜和神經系統的穩態，或通過調控IL-17的信號級聯，抑制炎癥因子的作用，從而減少了腸道炎癥。

在亨廷頓病通路中的組織轉谷氨酰胺酶2(Tgm2)，產生于小腸上皮細胞，研究證實為乳糜瀉和精神分裂癥的易感因子。而乳糜瀉在IBS患者中的發病率高于健康人4～7倍[11]，而Tgm2引起乳糜瀉和精神分裂癥的機制均與醇溶蛋白(Gliadin)相關[12]。醇溶蛋白為小麥面筋蛋白的部分組成，其對消化酶具有強耐受性，當機體處于應激、感染等情況時，引起腸道通透性異常，未消化的蛋白片段則進入機體，由于Tgm2與醇溶蛋白有極高親和力，它通過脫氨基和酰胺基轉移等改變了醇溶蛋白片段，繼而產生抗Tgm2抗體，醇溶蛋白來源的抗原表位誘發了精神分裂癥[13]，具體機制尚不明確，而抗Tgm2抗體導致了乳糜瀉。近年來，低FODMAP飲食作為IBS的治療方式得到公認[14]，其機制正是由于IBS患者腹部癥狀的產生與醇溶蛋白引起的免疫反應有關。而Tgm2在腸道和神經系統的雙重作用，均提示了其在IBS發病中可能存在的重要意義。在本研究中，M組大鼠經歷造模中應激等因素的刺激，可能影響了腸道通透性的改變，促進了醇溶蛋白的攝入，引起Tgm2表達上調，增加了抗Tgm2抗體并誘發了相關免疫反應，誘導了IBS的產生；而治療后Tgm2下調，提示了在減輕免疫應答、減少異體蛋白抗體等方面產生了作用。

IBS為功能性疾病，腦腸互動為其重要病機發現，提示IBS發病過程與中樞神經系統關系密切；因而，基因剪切通路的研究對IBS也意義重大。有研究[15]顯示，多聚谷氨酰胺結合蛋白1(pqbp1)為重要的RNA剪切因子，而剪接體通路中WW結構域結合蛋白11(Wbp11)作為其結合因子可約束其突變，防止相關神經系統疾病的發生；同時，這2個基因的表達異常會引起胚胎時中胚層和神經系統的發育異常，并誘發神經系統功能缺陷。另有研究[16]證實，部分敲除小鼠pqbp1基因后發現，其表現出明顯的焦慮認知損害和心理發育遲緩，而Wbp11的表達與pqbp1的功能極為密切，甚至認為保證Wbp11功能正常是pqbp1正確表達的唯一關鍵。除了對神經的調節，Wbp11也調控胃腸道功能的變化。研究[17]發現，NOD2蛋白所屬家族可調控腸黏膜與共生菌的炎癥反應，該蛋白則有助于先天免疫反應形成和保持腸黏膜平衡。

本次研究中還發現蛋白Cox6b1同時存在于代謝途徑、氧化磷酸化、阿爾茨海默病和亨廷頓病4條通路。經藥物治療后該蛋白的下調趨勢得以回歸，提示了其對IBS中腸神經系統和腸道運動功能可能存在調控影響。

本研究所用溫腎健脾方，由肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、黨參、白術、郁金、生姜、大棗組成。從中醫理論出發可以補脾胃、化水谷、升清陽、除腹瀉，又能充腎陽、固大腸。通過本研究發現ZZ組藥物在維持神經穩態方面的突出作用，尤其阿爾茨海默病、亨廷頓病通路的影響更能體現這一點。單純檢索組成藥物的研究進展發現，在維持神經穩態方面，肉豆蔻揮發油通過調節五羥色胺及單胺氧化酶有抗抑郁作用[18]，北五味子多糖通過減少腦組織中谷氨酸含量有抗焦慮和鎮靜催眠作用[19]，而白術多糖具有延緩神經細胞因缺氧復氧而導致細胞凋亡的能力[20]，盡管這些單藥在復方結構中與本次研究結果是否存在相關性，但它們仍提示了溫腎健脾方在維持神經穩態方面的作用值得進一步研究和驗證。