低溫脅迫下外源激素對番茄SlMYB102轉錄因子表達量的影響

李夢丹，王美玲，郭仰東，張喜春

（1.北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2.中國農業大學園藝學院，北京 100193）

番茄（Solanum lycopersicum）是世界上最重要的蔬菜之一，由于其品種多樣、營養豐富、用途廣泛等優點，目前已經成為人們日常生活中最需要的蔬菜之一［1］。番茄是喜溫植物，多數番茄品種在溫度低于10℃時生長發育受阻，當溫度低于6℃時表現明顯的冷害癥狀［2］。冷害會破壞植物的細胞結構和功能，從而引起植株代謝失調、活性氧積累，進而破壞細胞生理和生化代謝過程，給其產量造成了較大的損失［3］。

當植物遇到低溫脅迫時，為了適應脅迫帶來的傷害，會激活一系列細胞反應和分子機制，從而導致多種植物基因表達的改變，這些基因的產物可以直接保護植物免受脅迫，或者進一步控制其他靶基因的表達。進而引起一系列的理化反應，建成一個信號調控網絡，以提高植物對逆境脅迫的耐受性［4-7］。其中，在植物響應和抵抗環境脅迫的研究中，目前已經發現了很多重要的轉錄因子，主要包括MYB［8］、WRKY［9］、bZIP［10］、NAC［11］等轉錄因子。

轉錄因子（Transcription factor，TF），也稱為反式作用因子，通常是指由基因編碼的一類蛋白質，這些基因與基因啟動子區域的相關順式作用元件特異性結合，從而激活基因表達［12］。MYB類轉錄因子是重要的轉錄因子家族之一，根據MYB域的數量，MYB家族可分為四類，1R-、R2R3-、3R-和4R-MYB蛋白［13-16］。R2R3-MYB蛋白是植物特有的，是植物中最豐富的物種，在植物的基因組中大約有100多個R2R3-MYB成員，積極參與植物生長發育、次生代謝以及生物和非生物脅迫應答［17］。

目前，在番茄中MYB轉錄因子的功能研究主要集中在番茄果實成熟以及非生物脅迫方面。已有研究表明，低溫、干旱和赤霉素等多種脅迫和激素可以誘導SlMYB113的表達，SlMYB113的過表達能夠增加花青素的積累，進而提高轉基因番茄的低溫耐受性［18］；在對番茄R2R3-MYB家族的51個基因做表達分析時，其中響應NaCl處理的基因有10個，響應ABA處理的基因有11個，響應低溫脅迫的基因有14個，說明番茄R2R3類MYB轉錄因子積極參與植物的非生物脅迫響應［19］。因此，轉錄因子與激素相互作用的機制和轉錄因子表達調控所依賴的途徑和所發揮的作用各不相同。

在前期MYB102基因研究中發現，該基因啟動子序列包含的順式作用元件中，大部分與逆境或激素響應等相關，還有光反應元件以及細胞分化和分生組織生長相關元件。其中，響應的逆境類型包括8個，響應相關激素類型包括2個生長素相關元件、4個脫落酸相關元件和1個水楊酸相關元件［20］。以此為基礎，本研究以番茄幼苗為試驗材料，通過噴施SA、IAA、GA3、6-BA、ABA、MeJA 6種外源激素，研究其對番茄轉錄因子SlMYB102基因表達量的影響，進而了解6種外源激素對SlMYB102轉錄因子應答低溫脅迫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

以實驗室自存俄羅斯栽培番茄品種Bolgogragsky（實驗室種質編號25）為材料。將番茄種子暗培養3～5 d催芽后播種育苗，并置于25/20℃（16/8 h，60%濕度，光照12 000 lx）的光照培養箱中培養。三葉一心時分苗至10 cm×10 cm營養缽中，進行常規培養。當幼苗長至四葉一心時進行外源激素處理試驗，外源激素采用SA（500μmol/L）、MeJA（100μmol/L）、GA3（400μmol/L）、ABA（100μmol/L）、IAA（100μmol/L）、6-BA（300 mg/L），以噴施去離子水作為對照處理。噴施過程中，葉正、背面均噴施，以表面附著一層液珠為準。每隔2 d噴施1次，共噴施3次。經激素處理的番茄幼苗置于4℃恒溫培養箱中，分別在低溫處理0、1、3、6、9、12、24 h時取番茄葉片于液氮中，并保存在超低溫冰箱中，用于后續基因表達量的檢測。試驗至少進行3個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA的合成 RNA提取采用Trizol試劑提取法。RNA提取后進行濃度和質量檢測，將良好的RNA樣品放于-80℃冰箱保存，用于后續試驗。利用全式金的反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，具體方法參照說明書。

1.2.2 實時熒光定量PCR 根據SlMYB102基因和內參基因Actin序列，設計熒光定量PCR引物（qRTPCR F：TGGTCTGCTATTGCTGCACG；qRT-PCR R：CGTGGACTGTGTGTCACTGG）。反應體系見表1，反應程序見表2，基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR反應體系

表2 qRT-PCR反應程序

利用TB Green Fast q PCR Mix在Step One Plus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上運行反應，循環40次。

1.3 數據處理

試驗數據處理采用2010版Microsoft Excel進行處理，數據的方差分析與顯著性測試采用SPSS26.0軟件進行，采用單因素方差分析（ANOVA）進行數據比較，利用Duncan’s新復極差法檢驗處理間差異的顯著性水平，并在P＜0.05水平上進行檢驗。

2 結果與分析

如圖1所示，在MeJA、GA3、IAA 3種激素處理下，SlMYB102基因的相對表達水平在1 h都出現上調，其中MeJA處理下上調倍數較高，高達8倍左右。隨時間延長，在MeJA、GA3、IAA 3種激素處理下，SlMYB102的表達水平下降，在6 h又迅速上調，上調倍數達到最高，分別高達15倍、10倍和5倍左右，隨后下調，在IAA處理下，24 h又出現了上調趨勢；而在6-BA和ABA 2種激素處理下，SlMYB102的基因相對表達水平在9 h達到最高，分別為3倍和8倍左右，隨后下降；在SA處理下，SlMYB102基因的相對表達量在9 h出現顯著上調，高達14倍，隨后下降，在24 h顯著上調，高達38倍。

圖1 SlMYB102基因在不同激素處理下的表達模式分析

3 討論

低溫冷害每年給蔬菜作物造成嚴重的危害，已有很多方法用來提高蔬菜作物的耐低溫能力，最直接的改善番茄對低溫抗性是選育耐低溫的新品種［21］。解決番茄低溫脅迫的最方便的是通過分子生物學技術將與抗寒性相關的基因轉入栽培的番茄品種中，或者提高番茄植株體內與抗寒相關基因的表達量來提高番茄品種的抗寒性。這種方法既可以避免優良基因的丟失，又可挖掘植物體內與抗寒相關的功能基因，為今后的番茄抗寒性育種提供理論支撐［22］。

植物對于非生物脅迫的抵抗能力與轉錄因子的調節功能密切相關。在植物進化過程中，MYB轉錄因子的功能也變得更加多樣化。MYB轉錄因子普遍分布于植物中，基本涉及植物生長和代謝的所有過程［23］。研究已發現非生物脅迫（如低溫、干旱等）能誘導植物體內R2R3-MYB轉錄因子的表達，進一步直接影響或者間接調控一些抗性相關基因的表達，啟動防御機制抵抗外界不良環境［24］。在本研究中番茄SlMYB102基因是MYB家族中R2R3-MYB類轉錄因子，已有研究表明，番茄SlMYB102受NaCl、ABA以及低溫3種非生物脅迫誘導，在3種脅迫誘導下，SlMYB102基因表達量都會上升［25，26］。在轉錄因子的啟動子中存在多種作用元件，非生物脅迫誘導啟動子順式作用元件與轉錄因子相互作用，在分子水平上調節植物對非生物脅迫的抗性［27］。而本試驗研究的SlMYB102啟動子的作用元件包括多種與激素相關的元件。

激素在植物抗寒調控網絡中也發揮了重要作用。比如外源ABA可以提高甘蔗的抗寒性，外源ABA、GA3和6-BA對冬小麥的抗寒性有所幫助，茉莉酸甲酯處理對青椒冷藏過程中膜脂代謝影響的研究表明，MeJA可改善青椒的冷害狀況等［28-30］。本試驗結果表明，在ABA、GA3、IAA、SA、6-BA、MeJA 6種植物激素的誘導下，SlMYB102基因對于6種不同激素均有響應，并呈上調表達模式，并且此結果與啟動子順式作用元件分析相符合，SlMYB102作為MYB轉錄因子R2R3-MYB亞家族的基因，推測SlMYB102基因可能也參與到激素對植物抗寒的調控通路上。有研究克隆了R2R3類型MYB轉錄因子AtMYB15發現，該基因受低溫誘導表達，可同ICE1互作并與CBF基因啟動子區域的MYB順式元件結合，從而提高擬南芥植株抗寒性［31］。紫甘藍遭受低溫脅迫時可以通過基因BoPAP1的急速上調來促進花青素的合成從而抵御寒冷［32］。還有研究表明，ABA、GA都參與到了植物生長發育和對非生物脅迫的適應性反應中［33］。在葡萄休眠芽中外源施用ABA可提高CBF/DREB1轉錄因子VvCBF2、VvCBF3、VvCBF4和VvCBF6的表達［34］。

目前，MYB轉錄因子與激素之間的研究較少。尤其MYB類轉錄因子中作為與抗性有關的一類基因，在將來的研究中可以將其與環境脅迫相關的植物激素相結合，進行更深入的研究。