淹水對金葉冬青葉片色差及生理生化指標的影響

周余華，顧敏敏

（江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400）

金葉冬青（Ilex cornuta‘Oigon’）是冬青屬常綠小灌木，單葉互生，葉緣疏生小刺。一年四季葉片都保持金黃色，適用于花園、廣場和其他綠化區域內種植。金葉冬青作為新推出的一個花園觀葉植物品種，耐寒，也很耐修剪。可以修剪成球狀、塔狀、層狀等特殊造型，在造景方面可以和其他植物相配置，可叢植或孤植，是具有良好發展前景的常綠彩葉植物［1］。

被發現和引進的冬青屬植物品種在中國就有四分之一左右。對中國來說，關于其藥用價值的學術研究是冬青屬植物現階段的主要方向［2］。即使近年來植物界對冬青屬植物的園林應用價值方面較為關注，但是其不足之處還有很多。例如，對于能夠科學并合理地進行園林應用的植物品種，只有冬青、豆瓣冬青等幾個少數品種，與國外相比較，對冬青屬植物的研究遠遠不夠［3］。

近年來城市園林的發展比較樂觀，但是惡劣的環境條件是由來已久的問題，對園林植物的影響很大。對全人類來說，最具破壞力的自然災害中就包括洪澇災害。據聯合國糧農組織和國際土壤學協會繪制的世界土壤圖，全球約12%的土壤常年處于過濕狀態［4］。目前，關于其他植物的水脅迫研究比較多，而與金葉冬青淹水脅迫有關的研究報道較少。任貴軍［5］研究表明，淹水脅迫下銀杏葉片的葉綠素含量不斷降低，Fo明顯上升，Fm、Fv/Fm、Fv/Fo均表現為顯著降低的趨勢；蔡金峰［6］研究發現，澇漬脅迫下，烏桕葉片的MDA含量隨淹水時間的持續而逐漸增加。彭秀等［7］、王義強等［8］在淹水條件下，分別對中華蚊母、銀杏的研究表明，可溶性總糖的含量在試驗前期呈現出上升的趨勢，但是試驗后期卻處于下降的狀態。本試驗試圖在淹水脅迫條件下，對金葉冬青的色差及生理特性進行研究，以期為深入研究金葉冬青的耐澇性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為金葉冬青。選取生長旺盛、長勢一致的二年生金葉冬青扦插幼苗30株，共3組重復，移至帶托盤的花盆中（花盆直徑22 cm、高19 cm）。脅迫處理前維持金葉冬青正常生長。

2018年10月7日起開始進行試驗，設置淹水的水面位于根頸2 cm。淹水處理采用“雙套盆法”［9］，即在塑料桶內放入栽有二年生金葉冬青扦插苗的花盆，定期續水，保證2 cm的淹水深度。測定時間為中午12：00，每隔5 d一次，直到葉片無法采樣為止。選取生長點下第3～5片葉進行相關指標的測定，同時采集植株中上部的葉片，快速放置于有冰塊的保鮮箱內，并迅速送到超低溫冰箱內保存，用于測定滲透調節物質和丙二醛的含量，樣品袋上需做好相應的標記。當天測定數據及時導出，并做好備份工作。試驗區位于通風、光照良好的開闊場地，設置雨棚，防止淋雨對試驗造成影響。

儀器：梅特勒ML204型萬分之一天平；美國MD SpectraMax 190波長酶標儀。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 葉片色差測定 選用CM-700 d/600 d分光測色計，第一次測出的數據作為標準色，之后的數據則為對比色，主要測定△L、△a、△b、△Eab等指標。

1.2.2 葉片熒光測定 選用Handy PEA高速連續激發式熒光儀對葉綠素的熒光參數進行測定。對待測的金葉冬青葉片進行30 min的暗反應后，測出Fo、Fm、Fv/Fm以及Fv/Fo等指標的值。

1.2.3 葉片光譜測定 選用Unispec-SC型光譜分析儀，測定R640、R700和R800等參數值，依據葉片反射指標來計算葉綠素的含量。

1.2.4 葉片可溶性糖、可溶性蛋白質含量的測定可溶性糖含量測定采用蒽酮法［10］，可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法［11，12］。

1.2.5 葉片丙二醛（MDA）含量的測定 試劑盒法測定MDA含量［13］。

1.3 數據統計與處理

運用Excel進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 淹水對金葉冬青葉片色差的影響

金葉冬青在淹水條件下，由于試驗時間的延長，植株葉片的色彩會發生明顯的變化。從圖1可以看出，隨著金葉冬青淹水脅迫時間的延長，葉片的顏色由最初的金黃色漸漸變紅，最后至紅褐色。從第1天到第23天期間，葉片的色彩逐漸變深，但是在第39天之后植株的葉色變化沒有之前明顯。

圖1 淹水脅迫下葉片色彩的變化

Lab色能夠感知并測量任何顏色，亦可以利用△L、△a、△b和△Eab來對標準樣與測試樣的色差進行表示：如果△L的值為正，則表示測試樣的顏色比標準樣的顏色要淺或白，為負則表示葉片顏色偏深或黑。如果△a的值為正，則測試樣的顏色比標準樣的顏色要紅，為負則表示葉片的顏色偏綠；如果△b為正，則測試樣的顏色比標準樣的顏色要黃，為負則葉片的顏色偏藍；△Eab代表的是總色差，可以作為一個指標用于色差的評定，它的值越大，說明葉片的色差越大，反之則表示葉片的色差越小［14］。

從圖2可以看出，△L、△a、△b三者的值在10月17日（第11天）前變化很小，說明在這11 d內，金葉冬青對淹水較適應；從第11天后到10月29日（第23天）間急劇變化，說明淹水已經對金葉冬青產生明顯的影響，在這12 d中，金葉冬青葉色上的變化表明淹水已經影響到金葉冬青正常的生理活動；第23天之后，金葉冬青的葉色再次趨于穩定，說明金葉冬青已經處于淹水的傷害之中。

圖2 淹水脅迫下△L、△a、△b的變化

△a的變化：淹水脅迫對△a的影響總體上不大，并且變化相對平緩。△a的值始終大于0，表明隨淹水時間的延長，金葉冬青的葉片逐漸變紅。且第17天的△a的值是第11天的6倍多，在第23天之前淹水條件對金葉冬青的影響較大，而之后△a的值趨于平緩。

△L、△b的變化：淹水脅迫對△L、△b的影響較大，第23天之后變化幅度較小。△L、△b總體上均為負增長，表明隨淹水時間的延長，葉片顏色偏黑和偏藍。第6天均為負值，第11天均變為正值，之后又均變為負值，且不斷負增長，第11天至第23天變化極為明顯，分別降低了9.5、8.3倍。

△Eab的變化：從圖3可以看出，隨淹水時間的延長，金葉冬青葉片的總色差△Eab變化很明顯，呈直線上升趨勢。第11天到第23天之間的3次色差測定，總色差的值直線上升，增加了6.3倍，可能是金葉冬青苗木受到淹水脅迫的影響，從而表現出葉片色彩的變化。第23天之后，葉片總色差變化總體上呈波浪起伏，相對緩慢地增加。

圖3 淹水脅迫下總色差△Eab的變化

2.2 淹水對金葉冬青葉片熒光特性的影響

2.2.1 淹水對金葉冬青葉片Fo、Fm的影響 當PSⅡ反應中心在完全開放的狀態下的熒光產量，稱作為初始熒光，即Fo，亦稱為基礎熒光；而當PSⅡ反應中心在完全關閉的狀態下的熒光產量，可以稱為最大熒光，即Fm［15］。

從圖4可以看出，在試驗次數增加的情況下，金葉冬青葉片的初始熒光Fo總體上呈現大幅下降的趨勢。至第23天其Fo降低了58.6%，表明金葉冬青對淹水脅迫較敏感，但是之后其Fo反而略上升，說明金葉冬青通過自身的調節，減少了淹水脅迫對PSⅡ的破壞程度。而金葉冬青的最大熒光Fm呈下降的趨勢，至第23天Fm的值變化顯著，下降了75.8%，第23天之后則呈相對平穩不變的狀態。

圖4 淹水脅迫下初始熒光Fo、最大熒光Fm的變化

第23天后Fm與Fo的值趨于接近的狀態，且隨試驗時間的延長兩個參數的值更加接近，表明PSⅡ反應中心完全開放和關閉時的熒光產量幾乎相同，其受到了明顯的破壞，而金葉冬青所受到的影響較明顯。

2.2.2 淹水對金葉冬青葉片Fv/Fo、Fv/Fm的影響 Fv/Fo可以作為脅迫條件測定光化學反應狀況的一項重要的測試指標。Fv/Fm對金葉冬青的葉片來說，在光合作用的利用方面起著決定性的作用，這兩個參數值對研究金葉冬青所受到淹水脅迫的影響是否顯著很重要［16-18］。

由圖5可知，第1天至第34天（11月9日），Fv/Fo與Fv/Fm的值呈直線下降趨勢，分別降低了86.5%、75.1%，表明淹水條件對金葉冬青的生長產生了很大的影響。同時，淹水脅迫下金葉冬青的PSⅡ反應中心產生不可逆轉的損傷，妨礙了葉片的光合過程。第34天之后，二者的值均明顯提高。第44天到第49天，兩個參數的值分別上升了6.9、3.2倍；第49天至第54天，兩個參數的值分別下降了79%、63%。出現這種情況可能是因為受到天氣情況的影響，其他測定時期所得到Fv/Fo、Fv/Fm的值均趨于平穩且波動幅度不大，但是兩個指標都達到了最小值，說明雖然金葉冬青對淹水脅迫產生了耐受性，但是反應中心受到了比較嚴重的破壞。

2.3 淹水對金葉冬青葉綠素含量的影響

對于植物來說，有一種為其生長、開花結實等生命周期提供所需營養的物質，就是葉綠素。植株葉片的光合作用強度能夠用葉綠素的含量來反映。

圖6中，參數R800/R640和R800/R700的值與葉綠素含量呈正相關。因此，可以清晰地看出在整個試驗過程中，大多次試驗中葉綠素含量的變化是處于平緩、略增加的狀態，葉綠素含量的變化不明顯，說明一定的淹水條件能夠使葉綠素含量增加，光合作用增強。但是，第28天和第67天測定的數據高于其他次的試驗數據，第23天R800/R640的值分別上升和下降了76.3%、37.2%，R800/R700的值分別上升和下降了36.4%、26.2%；第60天R800/R640的值分別上升和下降了33.7%、33.4%，R800/R700的值分別上升和下降了37.5%、30.4%。第28天和第67天這兩次測定中，出現這種突然增加的情況的原因可能是，氣候條件或天氣狀況等不確定因素，不利于金葉冬青的生長，此外水脅迫對其生長狀況亦造成不良的影響，金葉冬青為抵抗種種不良因素，使得葉綠素含量顯著增加。

圖6 淹水脅迫下R800/R640、R800/R700的變化

2.4 淹水對金葉冬青葉片可溶性糖和可溶性蛋白質含量的影響

可溶性糖是重要的滲透調節物質，易受淹水脅迫的影響，植物為了適應惡劣的環境會積累可溶性糖，且為植物提供能量，可以減輕植株所受到的傷害；蛋白質對植物來說是重要的結構和功能物質。淹水條件下會影響植物蛋白質的合成，所以它能夠反映植物在逆境中所受的傷害程度；二者均通過滲透調節，降低水勢，維持細胞的正常代謝［19，20］。

由圖7可知，金葉冬青在淹水脅迫下，由于試驗次數的增加，金葉冬青葉片可溶性糖含量呈緩慢上升的趨勢，表現為升、降的規律性變化。第1天至第6天可溶性糖的變化較明顯，升高了46.1%，第11天至第84天僅增加了20%，增長較為平緩。由此說明，淹水脅迫對可溶性糖含量具有一定的積累作用，這也是適應淹水脅迫的結果。

圖7 淹水脅迫下可溶性糖的含量變化

圖8表明，金葉冬青葉片可溶性蛋白質含量的變化表現為升、降的規律性變化，大致呈上升趨勢。但是其蛋白質含量時低時高，第60 d與第67 d相比下降了32%。因此，淹水脅迫的環境條件對金葉冬青葉片產生了嚴重的影響，增加了金葉冬青葉片蛋白質的合成。

圖8 淹水脅迫下可溶性蛋白質的含量變化

2.5 淹水對金葉冬青葉片丙二醛（MDA）含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要產物，能夠反映膜脂過氧化的程度。對于植物來說，衡量植株受損害程度的一個極為重要的指標，就是植物體內丙二醛的含量，對研究淹水脅迫有重要的意義［21］。

由于所受到的淹水時間延長，金葉冬青葉片的MDA含量在不斷變化。由圖9可以看出，第1天至第60天的試驗過程中，MDA的含量呈波動上升，波動幅度比較穩定。第72天至第84天，MDA的含量波動較大。第72天至第78天，MDA的含量增加了47.5%；第78天至第84天，則下降了42.6%，上升以及下降的幅度很大。因此，金葉冬青在前12次的試驗過程中，MDA的含量變化波動不大，表明金葉冬青受到了澇漬環境的影響，使MDA的含量有規律的增加，且這種影響是在忍受范圍內的。第67天測定之后，MDA含量波動挺大，可能是由于金葉冬青為了抵御淹水條件，產生的消極影響比較強烈。

圖9 淹水脅迫下MDA含量的變化

3 小結與討論

金葉冬青淹水脅迫采用“雙套盆法”，分析淹水脅迫下二年生金葉冬青的葉片色差、葉綠素含量、熒光特性、滲透調節物質以及丙二醛等相關指標的變化。通過84 d的淹水脅迫，隨著脅迫不斷持續，金葉冬青葉片的顏色變暗，葉片的Fo、Fm值、Fv/Fo與Fv/Fm的值呈現直線下降的趨勢，直到10月29日（第23天），此后各值趨于平穩。說明在第23天前，淹水脅迫對金葉冬青葉片的形態色澤、葉片生理因子的影響產生劇烈的變化，此時期內，金葉冬青受到淹水的影響，植株生活力不斷降低。可溶性糖、可溶性蛋白質和MDA含量在整個試驗過程中，整體呈上升趨勢；可溶性糖、可溶性蛋白質在前6 d內不斷增加，表明植株不斷積極抵消淹水脅迫的不良影響，金葉冬青能夠對淹水脅迫的環境作出響應并能進行自我調節；MDA含量在10月29日（第23天）前總體平穩變化，之后則有較明顯的上升趨勢，說明隨淹水脅迫的不斷持續，對金葉冬青的傷害也愈趨明顯。葉綠素的含量處于平緩的增加狀態，表示一定的淹水條件能夠使葉綠素含量增加。

綜上，金葉冬青葉片的色差和各個相關生理指標，在淹水條件下受到顯著影響，并且由于淹水脅迫的持續進行，金葉冬青所受到的損傷處于不斷加重的狀態。但是，金葉冬青經過84 d的試驗，依舊處于存活的狀態，且淹水180 d后，成活率為20%。因此，金葉冬青作為城市園林綠化新引進的彩葉樹種，有一定的耐澇能力，可以適應較長時間的淹水脅迫，然而長時間的淹水會對其生長會造成嚴重的抑制作用。

淹水脅迫通常會使植物葉片的葉綠素含量降低，例如不結球白菜的葉綠素含量明顯下降［22］。然而有一些植物在淹水條件下卻增強了葉綠素的合成，使得葉綠素的含量增加，即淹水脅迫條件并不會減少植物葉片光合色素的含量［23］。在丁香［24］、煙草［25］的研究中，這兩種植物葉綠素的含量明顯上升，MDA含量顯著增加，可溶性糖的含量因為試驗的時間變長而增加，本研究的結果與該結果相符合。

由于本試驗處于相對理想的環境條件，金葉冬青的耐澇性可能會隨著外界環境條件的變化而發生改變，例如溫度的升高或下降、光照的強弱。本試驗中，對于葉綠素含量并不是通過試驗提取的方式獲得，僅僅通過計算的方式繪制出其變化趨勢，非具體的數據可能存在偏差；且沒有測花青素的含量，該指標對色差的數據分析很重要。Perata等［26］首次在洪水研究中利用擬南芥抗洪性的自然變異，有趣的是，擬南芥的抗洪性與水分脅迫下的葉柄生長呈負相關，但與淀粉和可溶性糖的初始量無關。本試驗對于苗木的葉柄、根徑和株高等相關指標未進行測定，淹水脅迫可能對其產生一定的影響。以上情況對試驗的結果有著直接的影響，可能會帶來耐澇性的差異，試驗結果需要進一步驗證。