褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎萌發及幼苗生長的影響

石桃雄，朱麗偉，王紅霞，黃 娟，陳慶富

（貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心，貴陽 550001）

褪黑素是一種小分子激素類物質，在1917年被首次發現于牛腦松果體中，該種未知物質可以讓蛙皮膚黑色素褪色變白［1］。至1958年，褪黑素的化學結構才被鑒定出，命名為Melationin［2］。1969—1995年，又有很多學者相繼在不同地區的被子植物中檢測出該種物質，含量較低，為ng/g水平［3，4］。但在某些藥用植物的種子中，褪黑素含量可達μg/g水平［5］。

近年來，隨著人們對褪黑素研究的深入，發現褪黑素在植物抗逆性反應中至關重要。徐向東等［6］研究了外源褪黑素對高溫脅迫下黃瓜幼苗活性氧（ROS）代謝的影響，發現褪黑素能抑制黃瓜葉片ROS產生，提高抗氧化酶系的活性和抗氧化物質的占比，維持脂膜的完好性，增強幼苗對高溫逆境的抵抗能力。Zhang等［7］研究發現，褪黑素能夠顯著提高鹽脅迫下黃瓜種子的發芽率，以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，外源褪黑素能誘導抗氧化物質基因表達以減少鹽脅迫引起的氧化損傷。Li等［8］研究發現，施加1μmol/L褪黑素能夠減少湖北海棠葉片氧化損傷，減緩葉綠素的降解，提升葉片的光合速率，有效緩和鹽脅迫對湖北海棠生長的脅制作用。鹽脅迫對大豆苗期鐵氧還蛋白基因PetF的表達也具有抵制作用，而添加適宜濃度褪黑素能夠加強大豆中該基因的表達［9］。褪黑素能提高小麥幼苗的耐旱能力，使其根系的吸水能力變強，還可使其氣孔張開，蒸騰作用速度加快，提升植物光合能力，使其快速恢復生長［10］。多胺能維持細胞的完整性，減輕低溫造成的細胞膜傷害。研究發現，外源褪黑素處理煙草懸浮細胞后，細胞內精氨酸脫羧酶活性增強，致使細胞內多胺的含量增加，以提高對低溫的抗性［11］。

蕎麥生長周期短（80～100 d）、抗旱、耐瘠，營養和保健作用良好，是中國重要的小宗雜糧作物。蕎麥膳食纖維高于小麥、大米和玉米等谷類作物，且含有谷類作物沒有的蘆丁（維生素P）和葉綠素等成分，能降低人體血脂和膽固醇含量，有抗輻射、抗氧化、防治心血管病和腦血管出血等作用［12］。鹽脅迫是造成農作物生長危害的主要原因之一，土壤鹽漬化對全球農業發展具有重要影響。為了充分利用鹽漬化土地，抗逆性強且營養價值豐富的蕎麥成為適宜的作物之一。為研究褪黑素對苦蕎鹽抗性的作用，本研究以苦蕎自交系WTX2為試驗材料，研究褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎的萌發、根長、幼苗鮮干重、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的變化規律，以期為提高苦蕎耐鹽能力研究提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎種子由貴州師范大學蕎麥研究中心提供，為穩定的苦蕎自交系WTX2，種子在做此研究前先進行了鹽濃度篩選，最終選取了濃度為100 mmol/L的NaCl溶液；褪黑素處理條件為25℃的黑暗環境。

1.2 試驗方法

1.2.1 發芽試驗

1）溶液配制。100 mmol/L的NaCl溶液：取5.85 g NaCl溶解后，定容至1 000 mL，備用。1 000μmol/L的褪黑素溶液：取褪黑素0.232 3 g，用微量無水乙醇溶解后定容到1 000 mL。用水稀釋配制成濃度為100和1 000μmol/L褪黑素溶液。褪黑素溶液配制過程盡量避光，然后將配好的溶液避光保存于4℃冰箱中備用。

2）種子精選。選取均勻飽滿的WTX2種子，放入去離子水中多次沖洗，祛除雜質，進行二次篩選。最后，將精選好的種子自然風干，分別用不同濃度的褪黑素于黑暗條件下處理6 h后取出，水處理作為對照（CK），晾干，備用。

3）發芽管理。試驗用的發芽盒規格為12 cm×12 cm，盒底部鋪雙層充分浸泡過鹽溶液的發芽紙，然后將苦蕎種子播于發芽紙上，放入智能光照培養箱中，培養溫度為25℃，16 h光照和8 h黑暗條件下循環。以胚根突破種皮1 mm為發芽標準，每日固定時間記錄發芽種子數，并及時給發芽紙補充NaCl溶液保持脅迫。在培養的第7天，每個處理取20棵幼苗，分別測根長、鮮重和干重。

1.2.2 酶液制備 分別在培養的第0、2、4和6天時取樣測定丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性。取0.3 g苦蕎幼苗，分3次加入8 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8），研磨至勻漿狀態，在10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液作為酶粗提取液。各項指標參考《植物生理生化實驗原理和技術》中的方法［13］。其中，MDA測定采用硫代巴比妥酸法；SOD測定采用氮藍四唑（NBT）還原法；CAT測定采用H2O2法。

1.3 數據處理

采用Excel軟件結合SPSS20.0統計軟件對數據進行整理、方差分析和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎種子萌發的影響

由表1可知，不同濃度褪黑素處理后，苦蕎種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和平均發芽時間均和對照無顯著差異，而經1 000μmol/L褪黑素處理后，種子的活力指數顯著高于CK，說明適宜濃度的褪黑素處理可明顯提高苦蕎種子的耐鹽能力。

表1 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎種子萌發的影響

2.2 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎根長和生物量的影響

由表2可知，與CK相比，100和1 000μmol/L褪黑素處理的種子在高鹽條件萌發時，其幼苗各項指標均較好。使用1 000μmol/L褪黑素處理后的種子幼苗根比CK長29.2%，幼苗鮮重和干重分別比CK高15.0%和15.4%。特別是幼苗鮮重顯著大于CK。

表2 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗根長、鮮重和干重的影響

2.3 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎幼苗MDA含量的影響

由圖1可知，高鹽脅迫下，苦蕎生長過程中其幼苗MDA含量均處于先下降后上升的趨勢，不同濃度褪黑素處理下幼苗MDA含量有一定的差異。CK處理的苦蕎種子在萌發第0、2和4天時幼苗MDA含量差異不顯著，但在萌發第6天時含量顯著升高，比第4天高258.2%；在施加褪黑素為10、100和1 000μmol/L濃度時，種子萌發第2天之后幼苗MDA含量均顯著上升，但上升幅度均較CK低，與萌發第4天相比、第6天的MDA含量分別升高了111.7%、129.4%和37.0%。

圖1 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗MDA含量的影響

2.4 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，各處理的種子在鹽脅迫萌發過程中，SOD酶活性都具有下降的變化趨勢，不同處理間又有明顯的區別。CK和10μmol/L處理的種子在萌發第0～4天時，SOD酶一直維持較高的活性，萌發至第6天時酶活性顯著下降，與第4天相比，分別下降了63.8%和51.2%；經100和1 000μmol/L褪黑素處理的種子，在萌發第0～2天活性較高，萌發至第4天時活性有輕微下降，萌發至第6天時活性下降明顯，與第4天相比，分別下降了45.1%和29.0%，差異并未達到顯著水平。

圖2 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗SOD酶活性的影響

由圖3可見，各處理的種子在高鹽脅迫萌發過程中，幼苗CAT酶活性均有不同程度的變化。CK處理的種子在萌發第0、2、4和6天時，CAT酶活性呈下降、上升又下降的變化趨勢，由萌發第0天的2.642 nmol/g·min（FW）降 至 第6天 的0.208 nmol/g·min（FW）；10μmol/L褪黑素處理的種子CAT酶活性呈先上升后下降的變化趨勢，在萌發第2天時，CAT酶活性顯著高于第0天，萌發第2～6天CAT酶活性呈緩慢下降的變化趨勢，不同萌發天數間差異不顯著；100μmol/L褪黑素處理的種子CAT酶活性呈下降的變化趨勢，萌發至第2天時CAT酶活性顯著低于第0天，萌發至第2～6天時CAT酶活性呈緩慢下降的變化趨勢，不同萌發天數間差異不顯著；1 000μmol/L褪黑素處理的種子萌發過程中CAT酶活性無顯著變化，萌發第0、2、4、6天時CAT酶活性分別是1.285、1.889、1.490和1.505 nmol/g·min（FW）。

3 討論

有研究表明，褪黑素可以促進小麥種子萌發，提高胚芽鞘長度和初生根數［14］，增加滁菊幼苗鮮重和干重［15］。水稻幼苗植株進行75 mmol/L Nacl脅迫15 d，噴灑200μmol/L褪黑素使植株干重顯著增加［16］。0.1～100μmol/L褪黑素處理明顯緩解水稻砷脅迫，其根長和鮮重均有明顯提高［17］。在本研究中，10μmol/L褪黑素處理對苦蕎應對鹽脅迫促進作用有限。100、1 000μmol/L褪黑素處理顯著降低了苦蕎鹽脅迫的毒害作用，苦蕎種子活力指數、鮮重均明顯高于CK，根長和干重也高于CK。

在植物遭遇高低溫、鹽堿等逆境脅迫時，細胞膜透性會有所增加。植物體內的丙二醛（MDA）含量是衡量細胞膜受氧化傷害程度最好的指標，其含量的大小可以直接反映細胞膜受傷的程度［18，19］。徐向東等［4］研究表明，施加外源褪黑素后的黃瓜幼苗葉片MDA的含量隨著褪黑素濃度的增大而減小，并且顯著低于對照組。黃益宗等［17］在砷脅迫下，對水稻葉片噴施0.1～100μmol/L褪黑素，也顯著減少水稻葉片MDA的累積。本研究結果與前人的研究結果一致，鹽脅迫會導致苦蕎幼苗中MDA含量增加，而褪黑素處理能有效緩解高鹽對細胞膜的傷害，降低苦蕎幼苗的MDA含量。

SOD和CAT是在植物保護系統中起重要作用的兩種酶，在植物處于逆境條件時，它們能通過相互協作，減少活性氧，降低植物細胞受傷害的程度［20］。在本研究中，鹽脅迫條件下，苦蕎種子經100、1 000 μmol/L褪黑素處理后，SOD和CAT酶活性雖然也處于下降的變化趨勢，但與CK相比，其變化是緩慢的，且萌發至第6天時，褪黑素處理的種子幼苗CAT酶活性均明顯高于CK。本研究結果與劉仕翔等［21］、余雪娜等［22］、劉月等［23］研究結果一致，表明褪黑素處理植物可提高其抗氧化物酶系統活性，減少逆境條件下產生的活性氧，進而降低植物受傷害程度。

4 小結

使用100、1 000μmol/L褪黑素濃度處理苦蕎種子，可減緩高鹽對細胞膜的傷害作用，使SOD和CAT酶活性維持相對較高水平，顯著減緩高鹽對苦蕎幼苗的毒害作用，使幼苗的根長、鮮重和干重均優于對照。