回收率實驗的意義和規范操作

(北京電子科技職業學院，北京 100176)

回收實驗是一種“對照性實驗”，向基質復雜、組分不完全清楚的樣品中定量加入已知組分，測定該組分含量與加入量關系的實驗，即為回收率實驗。結果用于判斷實驗過程存在的系統誤差，進而判定分析方法的正確性。通常回收率在100%±5%之間，說明系統誤差可控，符合方法學的合格要求；在100%±(6%～10%)之間，說明系統誤差可接受，但是不完全滿足方法學的要求，需要進一步優化；當回收率超過100%±10%時，說明系統誤差過大，不符合方法學要求，方法不成立。回收率范圍也會根據被測物含量以及復雜程度有所變化。實際上，影響回收率的因素很多，本文從易被忽略但是影響較大的環境因素、添加物的選擇及用量、回收率的計算三方面加以討論。

1 環境條件

實驗會受溫度、干濕度等環境因素的影響，其波動會引起檢測結果的變化。如：夏天在沒有溫控的實驗室標定碘標準滴定溶液，標定結果和方法誤差很難達到要求。有些特定的實驗即使在恒溫操作環境中，溫度、干濕度的波動也可會影響標定結果。如：工作曲線法測定苯系物，需要將標準物質、樣品、溶劑、微量注射器等在相同溫度下平衡，即溫度控制完全一致；操作過程中空氣流量及均勻性也會對結果產生顯著影響。在實際操作中，環境條件受到客觀制約較大，相對難以控制，也是主觀上經常被忽略的影響因素。對于受環境影響較小的實驗，回收率實驗基本能夠達到要求。但對于氣體、揮發性液體、需要冷藏物品、溫度敏感性反應等實驗，必須考慮環境因素的影響，否則回收率結果可能導致結論不具有說服力。因此，根據具體情況控制環境因素是確保回收率實驗數據可靠的重要前提。

2 添加物質的選擇及用量

添加物質和被測樣品的差異性是決定回收率實驗的關鍵，其中二者基體的一致性程度最為重要。當二者基體完全一致時，分離、提取、濃縮、檢測各環節不存在相互干擾，回收率應該為100%。實際上，二者完全一致的情況較難遇到，大多數情況都是二者一致性程度不高，需要通過回收率實驗證明分離、提取、濃縮、檢測各環節間的不會互相影響，滿足方法學要求。

2.1 添加物質的選擇

最理想的添加物質是基體與樣品完全一致的有證標準物質或基體接近(類似)的有證標準物質，國家認可的能力驗證機構提供的“指定值”物質(質控樣品)次之。實際上，空白基質(除沒有被測組分外其他與樣品完全一致)比較難獲得，大部分時候都不能滿足上述兩種情況，此時采用將添加物質直接加入被測樣品的方法考察回收率。

2.2 添加量的選擇

添加量一般選擇多點法，以3或5種添加量為宜，即三水平或五水平添加。實際操作時，考慮到時間成本，選擇1點或2點進行添加，回收率結果的說服力有限。添加量最重要指標是當加入2倍被檢含量時，回收率依然滿足方法學要求。

3 回收率的計算

以《食品安全國家標準 食品中維生素B6的測定(GB 5009.154-2016)》中第一法液相色譜法為例，對回收率的計算方法進行說明。標準中規定，樣品經過提取等前處理后，經C18色譜柱分離，高效液相色譜-熒光檢測器檢測，外標法定量微生物B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)的含量。

3.1 絕對回收率

添加標準樣品的量為(A)，檢測并計算得到的量(B)，二者的比值乘以100%，得到絕對回收率。如果有基質標準物質或者質控樣品，通過絕對回收率可以同時完成前處理方法適用性和基質干擾的考察；如果沒有標準物質或者質控樣品，則需要對二者分別進行考察。

公式(1)

式中：A為標準樣品添加量；B為測定的量。

3.1.1考察前處理方法的適用性

利用絕對回收率主考察樣品前處理方法的適用性，即是前處理方法的系統性誤差。將已知量的標準樣品按照前處理方法進行處理后進行測定，并按照公式(1)計算得到絕對回收率。具體到食品中維生素B6的測定，將3.4.4(GB5009.154-2016，下同)中的維生素B6混合標準中間液，按照需要稀釋后，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；按照5.1的實驗準備進行前處理操作，按照5.4的要求進行測定后，通過標準曲線計算含量為3種物質的含量分別為B1、B2和B3；分別將上述數據代入公式(1)，計算得到回收率。該數據反應了前處理方法對該樣品中吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的適用性。

3.1.2考察基質的干擾影響

利用絕對回收率主考察樣品基質的影響，將標準樣品加到空白基質中檢測并按照公式(1)計算得到絕對回收率。具體到食品中維生素B6的測定，將3.4.4中的維生素B6混合標準中間液，按照需要稀釋后，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；加入不含有吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的該食品中，按照5.4的要求進行測定后，通過標準曲線計算含量為3種物質的含量分別為B1、B2和B3；分別將上述數據代入公式(1)，計算得到回收率。該數據反應了樣品基質對樣品中吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺檢測結果的影響。

3.2 相對回收率

沒有基質標準物質或者質控樣品時候，可以用相對回收率考察檢測方法的適用性。向樣品(A)中加入不同含量(B)的標準物質，經前處理后，測定總含量(C)。計算方法為從C中扣除樣品中的含量(A)，與加入量(B)的比值乘以100%，得到相對回收率。

公式(2)

式中：A為樣品中目標物的含量(通過標準曲線計算得到)；

B為已知加入量；C為檢測得到的總含量(通過標準曲線計算得到)。

具體到食品中維生素B6的測定，操作如下：樣品按照標準規定進行前處理，測定得到吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；分別取3.4.5標準曲線的中的低、中、高3個濃度(B1、B2和B3)的標準樣品加入相應的樣品中(以一個濃度為例)；按照標準進行前處理3種物質的含量分別為C1、C2和C3；分別將上述數據代入公式(2)，計算得到回收率，該數值反應了檢測方法在不同水平下檢測方法的適用性。

此外，回收率實驗一般需要做3、5、7次，以其相對標準偏差表示該數據和真值的偏離程度。