實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19及CK5/6的診斷及療效分析

(南通大學附屬建湖醫院，南通 224700)

乳腺癌患者早期癥狀不明顯，晚期癌細胞侵襲周圍正常組織，并向遠處轉移，損傷多器官功能，造成病變，威脅患者生命[1]。乳腺癌的發病機制尚不明確，但已經證實多種危險因素與其發病有關；常見因素有月經初潮年齡早(<12歲)、絕經年齡晚(>55歲)、不孕及初次生育年齡晚(>30歲)、哺乳時間短、停經后進行雌激素替代療法等均可增加或延長體內雌激素的暴露，與乳腺癌發病密切相關[2]。除此之外，與生活習慣也有一定的關系，如，肥胖，吸煙，酗酒等，也會增加其患病的概率；乳腺癌一般表現為乳頭溢液等，但多數患者癥狀并不明顯，容易被忽視。乳腺癌患者中、晚期病情惡化，常伴有厭食，消瘦、貧血等癥狀產生[3]。近年來，乳腺癌的易感基因CK-19(細胞角蛋白19)及CK5/6(細胞角蛋白5/6)成為研究的熱點。有關研究表明CK-19、CK5/6的異常表達與乳腺癌的產生、發展和轉移密切相關，另有研究證明RT-PCR技術對乳腺癌患者的蛋白因子等檢測效果較好[4]。因此本文研究實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19、CK5/6的診斷及療效分析。

1 對象和方法

1.1 研究對象和分組

收集2018年4至2020年4月于我院就診的70例腺癌患者的癌組織及20例乳腺良性病變患者的病變組織，均為女性，最大年齡67歲，最小年齡32歲，抽血前均未接受化學治療和放射治療，所有患者均經手術治療證實，手術后均經病理診斷，術前經胸部X線、B超、CT及骨掃描等檢查未發現明顯的轉移灶，基本資料見表1。

表1 乳腺癌組、乳腺良性病組臨床資料對比

1.2 實驗試劑與儀器

離心機；Trizol試劑；逆轉錄酶；PCR擴增儀；反轉錄緩沖液。

1.3 方法

取癌組織及良性病變組織 RNA，分別將組織放在液氮中研磨成粉末后 ，按每 50mg組織加入 1mL Trizol 進行裂解。室溫靜置 5min，按照 200μL氯仿71mL Trizol的比例加人氯仿 ，劇烈振蕩 15s，使其充分混合 ，室溫靜置 5min后 ，4℃、12000×g離心 15min。 離心后混合物分為 3相，將上層水相移至另外 1個1.5mL離心管 中按0.5mL異丙醇/1mL Tfizol的比例加入異丙醇 ，充分混勻后室溫靜置10min，然后4℃ 、12000×g離心 10min。RNA在底部和側面形 成白色的小團沉淀。移去上清。在 1．5mL離心管 中按 1∶1加 入 75% 乙醇 ，來回顛倒混勻后 ，4℃、 10600×g離心 5min，小心棄上清。室溫靜置 10min使RNA沉淀干燥加入DEPC水溶解 ，在波長 260nm處測定核酸濃度 ，波長 280nm處測定蛋白質濃度 ，二者比值在1.8～2.1時表示RNA提取成功 ，提取的總RNA置人1.5mL無菌離心管中，離心5min，1250r/min，將dNTP混合物及反轉錄緩沖液全部加入逆轉錄酶管中配置成反轉錄反應液，混勻，加入探針及PCR緩沖液，配置成PCR反應液，定量PCR儀上行PCR擴增(如圖1 所示)，PCR反應體系為：模板5.0μL、PCR反應液15.0μL、水5.0μL。其中模板為實驗組樣品反轉錄產物或對照組樣品反轉錄產物。PCR反應條件：370C 10min，95℃15min，95℃15s，60℃1min，以β-actin為內參，共50循環，引物序列見表2。

表2 引物序列

圖1 PCR擴增儀

1.4 觀察指標

1.4.1檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌與乳腺癌良性病變組織中的表達

采用RT-PCR方法檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌患者中與在乳腺良性病變患者中的表達，并進行記錄。

1.4.2檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達

采用RT-PCR方法檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達，并進行記錄。

1.4.3檢測CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度

繪制ROC曲線，明確靈敏度與特異度，并進行記錄。

1.5 統計學

SPSS 17.0統計分析軟件對乳腺癌組、乳腺癌良性病變組CK-19與CK5/6水平、CK-19與CK5/6在不同乳腺癌分期中的表達等進行統計學分析，組間比較采用X2，P<0.05表示差異有意義。

2 結果

2.1 CK-19與CK5/6在乳腺癌與乳腺癌良性病變組織中的表達

乳腺良性病變中無CK-19mRNA、CK5/6mRNA表達，在乳腺癌患者中有26例CK-19mRNA表達、21例CK5/6mRNA表達(P<0.05)，見表3。

表3 乳腺癌與乳腺良性病變中CK-19mRNA、CK5/6mRNA的表達

2.2 CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達

在乳腺癌Ⅰ期-Ⅲ期中，Ⅱ期CK-19mRNA、CK5/6mRNA的陽性表達率最高、Ⅰ期最低，組間比較差距較大(P<0.05)，見表4。

表4 乳腺癌不同分期中CK-19mRNA、CK5/6mRNA的表達

2.3 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度

CK-19的靈敏度、特異度與ROC曲線面積均高于CK5/6靈敏度、特異度與ROC曲線面積，見圖2、表5。

表5 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度分析

圖2 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度分析

3 結論

據相關疾病研究機構調查顯示，全球范圍乳腺癌發病率逐年增長，是癌癥中威脅女性生命健康的首要疾病，且有一半以上發生在發展中國家[5]。我國每年約有40萬人確診為乳腺癌，隨著年齡的增長，發病率逐漸增加，乳腺癌一旦發病，判斷有無轉移對于治療和判斷乳腺癌預后有重要意義[6]。RT-PCR是一種較為敏感和特異的檢測技術，能在107外周血單個核細胞中檢出一個癌細胞，并預示腫瘤的微小轉移。許多學者利用此技術檢測乳腺癌患者淋巴結、骨髓及外周血的微轉移。因抽取外周血比抽取骨髓方便，又易被患者所接受，且乳腺癌主要為血行轉移，因此，本文研究實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19及CK5/6的診斷及療效分析。

由于目前在實體瘤中尚無特異、明確的腫瘤標記物，因此主要采用組織特異mRNA轉錄物為標記物，不同類型的正常上皮細胞顯示特定CK標記。CK-19在乳腺癌、胃癌、腸癌中有較高的表達，而不表達于正常的血組織和淋巴結，所以是上皮細胞性腫瘤的較好標志物[7]。上皮特異性標志物CK5/6，是上皮源性腫瘤細胞骨架的組成成分，屬于多基因家族之一，其成員超過30種，已有研究證實，CK在間葉組織(骨髓、淋巴結等 )中無表達 ，而在上皮性腫瘤組織 (乳腺癌 、宮頸癌 、肺癌等 )中有表達，而CK5/6由于其高度的上皮組織特異性以及乳腺癌細胞中的廣泛表達成為檢測乳腺癌患者腫瘤細胞的一個最常用的指標[8]。在本文研究中表明，在乳腺良性病變組中CK-19與CK5/6無表達，在乳腺癌中陽性表達較高。在許立生[9]等人對乳腺癌組織的表達中提出，CK5/6在乳腺癌中的陽性率高于癌旁正常組織，其表達水平的變化與乳腺癌的浸潤、轉移、預后聯系密切。在黃建康[10]等對乳腺癌的研究中提出，CK-19的陽性率為30%高于乳腺良性病變患者，這與本文研究中其在乳腺癌組織中的陽性率37%較為接近。

癌細胞脫離原發灶，播散至血循環或淋巴系統，最后進入靶器官實質，是一個復雜過程。轉移性癌細胞在循環系統及靶器官內面臨幾種命運：其一是發生凋亡；其二是處于休眠態；其三是持續增殖，腫瘤細胞脫落、侵襲并入血循環只是這一過程的最初階段，檢出的癌細胞并非一定形成轉移灶。有關研究表明，癌細胞隱性轉移會直接影響患者的預后，因此，準確的檢出技術以及腫瘤微轉移的特異性標志物對乳腺癌的治療至關重要。實時RT-PCR檢測是現階段敏感度較高的技術，可檢測mRNA水平的差異，其主要的檢測原理是采用cDNA作為模板進行定量擴增，得到大量的目的基因，每種細胞表達的基因范圍都有限，因此某些基因的mRNA不是廣泛存在于每個細胞或組織中，RT-PCR在理論基礎上檢測腫瘤細胞特異度表達的基因，從而判斷是否有完整的腫瘤細胞存在[11]。實時RT-PCR能在106～107個正常體細胞中檢測出1個腫瘤細胞，此外，還能檢測出1g組織、1mL體液中1個腫瘤細胞，因此實時RT-PCR能檢測到早期脫落得游離細胞，達到早期預判的目的[12]。目前已有研究證實CK-19與CK5/6是乳腺癌的標志物，其水平的高低與乳腺癌預后聯系密切。在本文中CK-19與CK5/6在乳腺癌Ⅰ-Ⅲ期中的陽性率逐漸增加。在任洪偉[13及李江濤[14]等運用實時RT-PCR檢測技術對乳腺癌的研究中提出，CK-19與CK5/6水平的表達與乳腺癌預后、轉移等密切相關，且隨著乳腺癌的分期增加其陽性率逐漸增加。本文研究結果與上述醫學者研究結果相似，且在本文中兩指標的特異度均為100%也可證實其對乳腺癌診斷的重要性。

綜上所述，實時定量RT-PCR對CK-19與CK5/6的表達進行檢測可判斷乳腺癌的轉移，且具有一定的診斷價值，值得臨床推廣使用。