QuEChERS法提取-液相色譜-質譜法檢測分析制藥園區污水中青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素殘留方法的建立

(1. 嘉興市杭環檢測科技有限公司，嘉興 314200；2. 杭州市環境檢測科技有限公司，杭州 310000)

隨著醫藥工業的發展，我國各省市均大力發展制藥園區，如國家級的浙江省臺州市化學原料藥基地等，制藥園區的發展，提高了當地政府的財政收入、增加了就業崗位、提高了老百姓收入等，但隨著偷排、漏排等現象的發生，同時也給當地環境系統造成了一定的污染[1-7]。青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素是最常見的抗生素，制藥園區企業生產家數較多，如青霉素生產企業有哈藥集團、石藥集團等等，其中青霉素鉀和青霉素鈉有近300個單品規格[8，9]。如果未經處理的污水中含有大量的青霉素等抗生素，會導致水系統、土壤系統等的污染，繼而通過食物鏈的傳遞，影響人們的身體健康，重者可能導致藥物中毒。因此，加強對制藥園區污水中青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素等抗生素殘留的監測，具有重要的現實意義[10-12]。

趙秋伶，張尤華，于曉艷研究了適體熒光分析法檢測養殖廢水中四環素類抗生素殘留的分析方法[13]，鄭璇，張曉嶺，李莉，研究了同位素內標-超高效液相色譜-串聯質譜法測定城鎮污水處理廠廢水中5種四環素類抗生素殘留的分析方法[14]。現階段，水體中抗生素殘留檢測主要以液相色譜法為主，前處理以固相萃取法為主，液相色譜法專屬性、靈敏度偏差，對于制藥園區污水中基質干擾較大的檢測不適用；固相萃取法操作較為復雜，試劑用量大，QuEChERS法是近年來發展起來的新型前處理方法，具有操作簡便、處理速度快、試劑用量小等優點。本實驗建立了QuEChERS法提取，液相色譜-質譜法檢測制藥園區污水中的青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀：shimadzu LC-30A型；三重四級桿串聯質譜儀：AB 4500 Trip型；電子天平：十萬分之一，AB135-S型；色譜柱：Waters BEH UPLC-C18柱(規格：100×2.1 mm、2.1 μm)；全自動固相萃取儀：AUTO Trace 80型；高速冷凍離心機：H205R型；水浴氮吹儀：H-148型。

1.2 實驗材料

青霉素標準溶液：編號：BWN5469-2016，規格：100 μg/mL；潔霉素標準溶液：編號：BWN5484-2016，規格：100 μg/mL；土霉素標準溶液：編號：BWN5109-2016，規格：100 μg/mL；四環素標準溶液：編號：BWN5366-2016，規格：100 μg/mL；慶大霉素標準溶液：編號：1ST7709B-100W，規格：100 μg/mL。

乙腈、丙酮、甲醇：分析純，500 mL/瓶；甲酸：優級純，500 mL/瓶；無水硫酸鎂、乙酸鈉、冰醋酸：分析純，500 g/瓶；QuEChERS凈化包：1 g MgSO4、500 mg PSA和500 mg C18；純化水。

1.3 色譜、質譜條件

1.3.1色譜條件

柱溫：30 ℃；色譜柱：Waters BEH UPLC C18質譜專用柱；流動相A：0.1%甲酸的水溶液，流動相B：甲醇；流速：0.15 mL/min；進樣量：10 μL；洗脫模式：梯度洗脫。洗脫表見表1。

表1 洗脫程序

1.3.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：ESI+；離子源溫度：560℃；電噴霧電壓：4500 V；輔助氣壓力：72 Psi；氣簾氣壓力：31 Psi；離子傳輸管溫度：350 ℃；碰撞氣：氮氣；檢測模式：多反應監測模式(MRM)。

1.4 溶液制備

1.4.1單一標準儲備溶液

取青霉素標準溶液(編號：BWN5469-2016，濃度為100 μg/mL)，移取1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至標線，搖勻，得青霉素標準儲備溶液(濃度：10 μg/mL)；同法配制潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素標準儲備溶液。

1.4.2標準曲線溶液

取1.4.1待測物單一標準儲備溶液，分別精密移取一定量，置不同的棕色容量瓶中，加甲醇制備每1 mL溶液含有青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素質量分別為0.005、0.01、0.1、1.0、5.0、10.0 μg的標準曲線溶液，加甲醇定容至標線，搖勻。

1.4.3樣品溶液1.4.3.1樣品預處理

隨機采集制藥園區污水樣品2.0 L，去除表面懸浮物，15 μm濾膜過濾，置棕色廣口瓶中，冷藏儲存(2～8℃)，24 h內有效。

1.4.3.2樣品溶液制備

量取預處理后的水樣100 mL，置旋轉蒸發儀控制溫度45℃，減壓濃縮至約5 mL；轉移至50 mL離心管中，用25 mL 1%的冰醋酸-乙腈溶液(V∶V=1∶1)清洗旋蒸儀，合并至50 mL離心管中；于離心管中加入乙酸鈉2.0 g、硫酸鎂5.0 g，渦旋3 min后，冷凍離心5 min(轉速控制8000 R/min)，取出；離心后的上清液全部轉移至50 mL離心管中，加QuEChERS凈化包，渦旋3 min后，冷凍離心8 min(轉速控制8000 R/min)；離心后的凈化液氮吹至近干(水浴溫度為45℃)，加甲醇1.0 mL溶解，渦旋1 min后，0.45 μm 濾膜濾過，即得。

1.4.4 標準測試溶液

取1.4.1青霉素單一標準儲備溶液(濃度：10 μg/mL)，移取1.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻；再移取0.2 mL上述溶液，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得青霉素測試溶液(青霉素濃度：200 ng/mL)；同法制備潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素測試溶液。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

制藥園區污水中含有較多的化工原料、中間體、藥用輔料和成品原料藥等有機物，基質成分十分復雜，且干擾成分較多，因此選擇合適的前處理方法，對方法的準確度影響較大。常用于污水中有機物的提取方法主要有：凝膠凈化色譜法、固相萃取法和QuEChERS凈化法等方法[15，16]。凝膠凈化色譜法，是采用固定相將待測物保留、洗脫的方式，將污水樣品進行富集、凈化，凈化效果好，但前處理時間長，且儀器價格高，不利于方法的推廣；固相萃取法，是采用固相萃取柱富集、凈化待測物，操作步驟繁瑣、處理時間長，且試劑用量大；QuEChERS凈化法是近些年發展起來的新型前處理方法，具有處理速度快、試劑用量少、凈化效果好等特點。實驗通過比較上述3種方法，對青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素加標濃度均為0.01 μg/mL的樣品進行提取。結果比較見表2。

表2 3種前處理方法回收率比較

2.2 質譜MRM方法的建立

取1.4.4標準測試溶液，選擇氣相色譜-質譜儀全掃描模式，將青霉素測試溶液進樣，找到5種待測物母離子；再設置氣相色譜-質譜儀掃描模式為產物離子掃描，找到5種待測物母離子對應的子離子，選擇豐度較高的2個子離子，其中1個作為定量離子，另一個作為定性離子，對這2個子離子進行去簇電壓和碰撞能量的優化，建立青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素多反應監測方法。優化后的MRM方法見表3。

表3 MRM方法參數

2.3 標準曲線、相關系數和檢測限考察

取1.4.2標準曲線溶液，每個濃度點測定3次，取平均值，以濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)計算曲線方程，以3倍信號噪音比值計算檢測限。結果見表4，典型譜圖見圖1。

表4 標準曲線、曲線方程、范圍和檢出限

圖1 典型質譜圖1.青霉素；2.潔霉素；3.土霉素；4.四環素；5.慶大霉素

2.4 回收率試驗

隨機采集制藥園區污水樣品2.0 L，按1.4.3樣品溶液方法進行預處理，量取預處理后的水樣100 mL，分別加入1.4.1青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素單一標準儲備溶液一定量，按1.4.3樣品溶液方法進行處理，制備含5種抗生素濃度分別為0.005、0.1和10.0 μg/mL的加標測試溶液，每個濃度測試溶液制備3份；按1.3色譜、質譜條件，分別將上述溶液進樣檢測，計算回收率和相對標準偏差。結果見表5

表5 回收率試驗結果

2.5 方法重復性試驗

隨機采集制藥園區污水樣品2.0 L，按1.4.3樣品溶液方法進行預處理，量取預處理后的水樣100 mL，加入1.4.1青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素單一標準儲備溶液一定量，按1.4.3樣品溶液方法進行處理，制備含5種抗生素濃度均為0.01 μg/mL的重復性檢查溶液，同法共制備6份重復性檢查溶液；按1.3色譜、質譜條件，分別將上述溶液進樣檢測，計算5種抗生素重復性RSD。結果，青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素重復性RSD分別為：3.25%、2.99%、4.02%、3.61%和3.54%。表明，方法具有良好的重復性。

3 結論

實驗建立了采用QuEChERS凈化法提取、凈化制藥園區污水中的青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素5種抗生素，液相色譜-質譜法定量、定性檢測的分析方法。針對前處理方法和檢測方法進行了討論，確定采用QuEChERS凈化法作為前處理方法，液相色譜-質譜法作為檢測方法；對質譜的多反應監測方法進行了優化，優化了碰撞能量和去簇電壓等；對方法的線性范圍、加標回收、重復性等進行了系統的考察。實驗結果證明，此方法操作步驟簡單、速度快、檢測結果準確，適用于制藥園區污水中極微量青霉素、潔霉素、土霉素、四環素和慶大霉素殘留的監測。